Identifying the mechanism for and predicting the metabolic shift between lipid accumula-tion and cell growth is a key research issue for microalgal biodiesel production. In this study, we propose a novel way to integrate a metabolic network model with a semi-empirical model (called “Droop model”) for predicting the lipid accumulation and cell growth simultaneously. At each time instant of mass balance model integration, the Droop model is used to predict the cell growth rate. Then, the Flux Balance Analysis (FBA) model is used to predict the rate of lipid accumulation, which is biochemically consistent with the predicted growth rate. In order to test the validity of the proposed approach, experiments are conducted for growing microalgae specie C. reinhardtii in a batch photobioreactor. Droop model’s parameters are estimated using the gathered data and model predictions for the lipid contents are verified. Parameter sensitivity analysis is conducted to investigate how the various parameters affect the cell growth and lipid accumulation. With the model, metabolic shift is simulated with time variation, and flux distribution movement is specified and described on a microalgae metabolism map. In addition, the relationship between phenotypes and internal fluxes is analyzed under several initial conditions. Ultimately, the integrated model will be extended to develop a multi-input system and/or applied to a large-scale open pond system.
본 학위논문에서는 현재까지 미세조류 바이오디젤 생산공정에 적용하기 위한, 미세조류 성장에서 대사변화 예측 모델을 개발하였으며, Droop 모델과 대사예측 Flux Balance Analysis 기법의 통합 모델을 제시하고 있다. 이 연구는 3가지 하위 목표를 가지고 있다. (i) Batch시스템에서 대사스케일과 거대스케일을 연결시키고, (ii) 모델의 파라미터 추정 및 모델 검증을 실시하며, (iii) 대사스케일에서의 분석과 메타볼세포 및 세포표현형 간의 관계를 알아본다.
미세조류 지질합성은 de novo 합성경로를 통해 Acetyl-CoA이 Malonyl-CoA로 변환되는 과정에서부터 시작되며, 이후에는 지방산의 길이가 길어지는 Elongation 현상을 거쳐, Triacylglycerol (TAG) 합성과정을 거치게 된다. 한편, 이번 연구에서 2가지 (i) Semi-empirical model과 (ii) Flux Balance Analysis method이 주로 사용된다. Semi-empirical model인 Droop model은 현상에 대해서는 예측이 가능하지만 실제로 어떤 인과관계가 있는 지 메커니즘에 대해서 알기 어렵다는 단점이 있다. 한편, Flux Balance Analysis method은 Stoichiometric matrix metabolic network model과 optimization method로 구성되어 있다. 이 방법은 Quasi-steady state를 가정하고 있기 때문에, FBA 모델만으로 ‘세포 외부환경’과 ‘시간’에 대한 플럭스 변화의 동역학을 나타내기 어렵다는 한계가 있다.
이번 연구에 대한 시작 동기로는, 미세조류 바이오 디젤 생산에 있어 Nitrogen starvation 조건에서, 세포성장과 지질합성 사이에서 대사이동이 발생하는 점은 큰 이슈임에도 불구하고, 현재까지 이에 대해 원리적으로 설명하고 예측가능한 모델은 개발되지 않았다는 점에서 출발하였다. 본 논문에서 제시된 통합 모델은 크게 2가지로, 반응기 내부의 Dynamics를 예측하는 Droop 모델은 Nitrogen substrate [$NH_4$], 세포내부 Quota [q], 세포 농도 [X]의 3가지 항으로 구성되고, 여기서는 [$NH_4$]가 Limiting nutrient로 간주한다. 또한, (ii) 2011년 Palsson 팀에서 개발한 C. reinhardtii 대사네트워크 모델 iRC1080은1706개의 대사물질과 2192개의 반응플럭스로 구성되어 있으며 세포성장과 지질합성의 목적함수들을 가지고 있다. 거대스케일의 Droop 모델 개발을 위해, Autotrophic 환경에서 Cell growth와 Substrate consumption의 실험데이터를 얻었다.
본 연구의 결과 및 토의로, 실제 실험을 통한 모델링에서, 실험 결과를 가장 잘 예측할 수 있는 Droop 모델의 파라미터를 결정하기 위해, 최소 제곱법 파라미터 추정기법을 사용하고, 다른 조건에서 진행된 실험값을 토대로 모델의 예측정확성에 대한 검증을 실시하였다. 또한, 파라미터의 변화를 ±20%씩 변화를 주어 민감도 분석을 실시하고, Q_min이 결과값에 가장 민감하게 영향을 미치는 것으로 도출되었다. 한편, 통합모델의 동적환경에 대한 내부 플럭스 변화를 알아보기 위해, 초기 [$NH_4$] 의 1.75mM일 때의 실험결과값에 대해 대사스케일의 분석을 실시하였다. 세포 성장속도와 지질 합성속도의 변곡점 지점이 32시간에서 나타나고, 35시간에서부터 급격히 변하게 된다는 것을 알 수 있었다.
또한, 대사 수준에서 분석으로는 중심대사 네트워크에서 ‘Acetyl-CoA → Malonyl-CoA’(CS) 플럭스와 ‘Acetyl-CoA → Cit’ (ACCOAC) 플럭스로 세포성장과 지질합성 속도를 나타낼 수 있음을 알 수 있었다. 마지막으로 [$NH_4$]의 초기농도 1.0-4.0mM에 따라, 세포성장과 지질합성 두 플럭스와 세포표현형인 세포농도 [X]와 지질축적농도 [Lipid] 간의 상관관계에 대하여, 개발된 통합모델을 이용하여 1h~50h 사이에서 시뮬레이션을 실시하였다. 그 결과, 1.0mM과 2.0mM [$NH_4$]의 경우 세포가 성장하다 지질 축적이 이루어졌으며, 3.0mM과 4.0mM에서는 세포성장이 두드러지게 나타났다. (그림 4.8, 4.9 참고) 이러한 분석을 통해, 두 대사 플럭스와 세포 표현형에 대한 관계를 알아보고, Macroscopic-scale의 [$NH_4$], [X], [Lipid]의 변화에 대한 내부 Flux의 변화를 예측할 수 있을 것으로 기대해볼 수 있다.
후속 연구로써는, 통합모델의 한계점을 개선하고 이를 응용하는 연구를 제안해볼 수 있다. (i) 모델에서 Lipid합성에 대해 개별 세포에 대한 최대 지질량에 대한 정보가 반영되지 않았다는 점을 개선하고, (ii) Limiting nutrient였던 [$NH_4$]에 국한했던 통합모델을 확장하고, (iii) 이를 Large-scale의 시스템, 이를테면 Open pond system에 적용하는 연구 등을 제안해볼 수 있다.
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