Chinese hamster ovary (CHO) cells are the most widely used mammalian host cell line for the produc-tion of therapeutic proteins because of the ability of human like glycosylated protein production. Glycosyla-tion which is a critical factor of quality is known to affect the biological activity, efficacy, in vivo half-life, and solubility. In this study, we focused on the sialylation which is one of the N-glycosylation structure can increase the serum half-life by preventing the degradation of terminal glycans and affects thermal stability and solubility. Glycosylation including sialylation was affected by numerous culture parameters such as cell lines, culture modes, and environmental factors. Among them, accumulated ammonia caused by glutamine metabolism significantly reduced the terminal sialylation of therapeutic proteins. It is however well-known the negative effect of ammonia on glycosylation including sialylation, the exact mechanism is still poorly understood. In this study, in order to understand the effect of ammonia on sialylation, glycosylation related mRNA transcript levels were evaluated with NanoString nCounter analysis system. And for overcoming the negative effect of ammonia, TCA cycle intermediates were used as glutamine substitutes.
To understand the effects of ammonia on therapeutic protein glycosylation patterns, recombinant CHO cells producing Fc-fusion protein were subjected to 10 mM ammonia. The addition of ammonia to the cultures reduced the relative proportion of acidic isoforms and sialic acid content of the Fc-fusion protein. Fifty-two N-glycosylation related gene expressions were also assessed by the NanoString nCounter system, which can provide digital readout using custom-designed color-coded probes. Among them, thirteen genes (gale, nans, gpi, man2a1, b4galt5, b4galt7, st3gal2, st3gal5, glb1, hexa, hexb, neu1, and neu3) were up-regulated over 1.5-fold compared to the control culture. Among them, expression level of neu1 and neu3 which have roles in reduction of sialylation was overexpressed over 2-fold. Additionally, protein expression level of neu1 and neu3 was also 1.5 ~ 1.7-fold increases in the presence of ammonia which are correlated with reduction of sialic acid content. To overcome the negative effect of ammonia, neu1 and neu3 siRNA were transiently transfected to the cells in the presence and absence of ammonia and significant enhancement of the relative proportion of acidic isoforms and sialic acid content of Fc-fusion protein were observed. Taken together, the results obtained in this study provide a better understanding of the detrimental effect of ammonia on N-glycosylation especially sialylation in rCHO cells.
In an effort to reduce the accumulation of ammonia in culture medium, three different TCA cycle in-termediates (alpha-ketoglutarate ($\alpha-KG$), citric acid, and succinic acid) and glutamic acid for a comparison were examined as a substitute of glutamine for rCHO cell line producing a Fc-fusion glycoprotein. Among them, $\alpha-KG$ showed the best production performance. When cells were cultivated with 4 mM $\alpha-KG$, the final ammonia concentration did not exceed 3mM, which is less than one fourth of that with 4mM glutamine. The replacement of glutamine increased the lag phase and reduced cell growth. However, it increased the specific productivity by 2.7-fold, resulting in a 1.3-fold increase in the maximum product concentration. Furthermore, the sialic acid content of the Fc-fusion protein with 4 mM $\alpha-KG$ was higher than that with 4mM glutamine in all cultures, most likely due to the lower ammonia concentration. The results of Western blotting and activity assays of intracellular $\alpha-2,3-sialyltransferase$ and extracellular sialidases are in good agreement with tests done to assess the sialic acid content of the Fc-fusion protein. Taken together, the data obtained here demon-strate that $\alpha-KG$ is a potential substitute for glutamine for improved glycoprotein production in rCHO cells.
In order to increase the overall production yield of therapeutic protein, fed-batch process has been the most widely used in biopharmaceutical industries. Because batch cultures undergo cell death by nutrient limi-tation in the late culture period, depleting nutrients supplementation such as glucose, amino acids, vitamins, minerals, and trace elements can be improved the culture duration and consequently increased the therapeutic protein production. In this study, for maximizing the therapeutic protein production, we optimized the culture temperature and feeding cocktail. We used two rCHO cell lines producing Fc-fusion protein and performed fed-batch culture in both shake flask and bioreactor scale. As a result of optimization of fed batch process, culture duration was prolonged over 7 days and maximum viable cell concentration was also approximately 2-fold higher than control batch culture for both cell lines. Consequently, maximum Fc-fusion protein concentration in the fed-batch process was increased 4.0 ~ 5.1-fold compared to the control batch cultures.
Furthermore, to provide additional enhancement of production yield, LiCl, a well-known inhibitor of glycogen synthase $kinase-3\beta$ ($GSK-3\beta$$), was used as a chemical enhancer. In this study, two rCHO cell lines producing Fc-fusion protein, derived from DUKX-B11 and DG44, respectively were used as a model cell line with different concentration of LiCl addition. Results indicated that cell growth was affected in a dose de-pendent inhibition and specific production rate (qp) and final Fc-fusion protein concentration were affected in a dose dependent enhancement for both cell lines. In bioreactor culture with optimal LiCl concentration, 10 mM, qp of both cell lines was increased 4.7 ~ 5.0-fold compared to the non-treated cultures. MFPC conse-quently was 2.1 ~ 2.2-fold higher than non-treated culture. Cell cycle profiles were monitored by flow cy-tometric analysis and the clear increase of G2/M phase of cell cycle with LiCl addition was observed in both cell lines. Furthermore, $GSK-3\beta$ inhibition by LiCl showed an anti-apoptotic effect on late culture period through the overexpression of bcl-2 which prevented the apoptosis by inhibition of apoptosis related protein expression such as cleaved caspase-3/7 and cleaved poly ADP-ribose polymerase. Taken together, LiCl im-proves the final Fc-fusion protein concentration by induction of G2/M cell cycle arrest and anti-apoptotic effect through $GSK-3\beta$ inhibition, and provides new chemical supplement for improving the productivity used for large-scale cultures of therapeutic glycoproteins.
In conclusion, sialylation was significantly reduced by accumulation of ammonia and it can be over-come by neu1 and neu3 knock-down or substitution of glutamine by $\alpha-KG$. For maximizing the overall pro-duction yield, fed-batch culture and LiCl, production enhancer, was very useful strategies.
Chinese hamster ovary (CHO) 세포는 인간 생산 단백질과 비슷한 당쇄화 구조의 단백질을 생산할 수 있는 능력 때문에 현재 치료용 단백질을 생산하는데 있어 가장 널리 사용되고 있는 숙주 세포주이다. 당쇄화는 치료용 단백질의 품질을 결정하는 가장 중요한 요소이며, 생물 의약품의 생리활성, 효능, 생체내 반감기, 용해도 등을 결정한다. 당쇄화 구조의 요소 중 하나인 시알산화는 당 단백질의 분해를 막아주는 역할을 하며, 이를 통해 치료용 단백질의 안정성, 생체내 반감기, 용해도 등을 결정짓는 요소로 알려져 있다. 시알산화를 포함하는 당쇄화 구조는 세포주의 종류, 배양 방법, 배양 환경 요소 등의 다양한 요소들에 의해 크게 영향을 받는다. 그 중에서도 글루타민의 대사를 통해 배지내에 쌓이게 되는 암모니아는 치료용 단백질의 시알산화를 크게 감소시키는 역할을 한다고 알려져 있다. 이런 암모니아의 해로운 역할은 잘 알려져 있지만 그것을 해결하기 위한 정확한 메커니즘은 아직 연구가 부족한 상황이다. 따라서 본 연구에서는 암모니아에의해 시알산화를 포함한 당쇄화에 관련된 유전자의 발현 패턴에 미치는 영향을 보다 자세히 분석하기 위해 NanoString nCounter analysis system을 이용하였다. 또한 이를 극복하기 위한 연구로 글루타민을 TCA cycle에 포함된 less ammoniagenic substrate로 대체 할 수 있는 방안에 대한 연구를 수행하였다.
먼저 암모니아가 치료용 단백질의 당쇄화 패턴에 미치는 영향을 분석하기 위해 Fc-fusion protein을 생산하는 재조합 CHO 세포주를 10mM의 암모니아가 포함된 배지와 포함되지 않은 배지 내에서 배양을 진행하였다. NanoString nCounter analysis를 통해 배양 샘플들의 당쇄화와 관련된 유전자 발현량을 분석하였고, 총 13개 (gale, nans, gpi, man2a1, b4galt5, b4galt7, st3gal2, st3gal5, glb1, hexa, hexb, neu1, and neu3) 의 유전자가 암모니아가 첨가된 조건에서 1.5배 이상 증가한 것을 확인하였다. 그 중에서도 특히 시알산화를 감소시킨다고 알려진 neu1과 neu3가 2배 이상 증가한 것을 확인하였다. neu1과 neu3의 단백질 발현량 또한 1.5배 이상 증가하였으며, sialidase activity도 동시에 증가하였다. 이를 확인하고자 시알산화 패턴과 시알산의 양을 분석하였는데, 앞선 결과와 마찬가지로 급격한 감소를 보였다. 이를 극복하고자 과발현 되는 neu1과 neu3의 siRNA를 제작하여 일시 발현 시스템을 이용하여 발현을 시켜 보았으며, 암모니아가 첨가된 상태에서도 시알산화와 알산양을 유지하는 결과를 확인하였다.
또한, 시알산화를 감소시키는 암모니아의 생성을 막아보고자 3 종류의 TCA cycle 중간 대사체 (alpha-ketoglutarate($\alpha-KG$), citric acid, and succinic acid) 들과 이전 연구에서 대체제로 연구가 되었던 glutamic acid를 글루타민의 대체제로 배양을 수행해 보았다. 이 4종류의 첨가물 중에 $\alpha-KG$ 를 첨가하였을 때, 최종 암모니아의 농도는 3mM이하였으며, 이는 글루타민을 사용했을 때에 비해 1/4 수준이었다. 비록 $\alpha-KG$ 를 사용하였을 때 세포의 비 성장 속도가 감소하는 경향을 보였지만, 비 생산 속도가 증가하고 배양 기간이 길어지는 효과를 통해 글루타민을 사용하였을 때에 비해 1.3배의 Fc-fusion protein의 생산성 증가를 보였다. 배지에 쌓이는 암모니아의 양이 감소함을 통해 silidase의 발현 양 및 activity가 감소하는 경향을 보였으며, 반대로 sialyltransferase의 발현 양과 activity는 더 높게 유지됨을 또한 관찰하였다. 결과적으로 글루타민을 사용하였을 때에 비해 더 많은 시알산화된 단백질이 유지되는 것을 확인하였다. 따라서 $\alpha-KG$ 는 시알산화 강화를 위해 글루타민의 대체제로서 충분히 사용 가능함을 보였다.
치료용 단백질의 생산성을 높이기 위해서 산업계에서 가장 널리 사용되고 있는 배양 방법은 유가식 배양이다. 회분식 배양은 배양 후반부에 영양분들이 소모가 되면서 세포 사멸과 함께 생산성이 저해되는 현상이 나타나기 때문에, 배양 중간에 glucose, amino acids, vitamins, minerals, and trace elements와 같이 소비된 영양분들 첨가해 주는 유가식 배양 공정이 널리 사용되고 있다. 소비된 영양분들의 첨가는 세포의 성장을 지속 시켜주고, 배양 기간을 늘려주며, 치료용 단백질의 생산성을 높게 유지 시켜주는 역할을 하게 된다. 따라서 본 연구에서는 치료용 단백질의 생산성을 극대화 시킬 수 있는 유가식 생산 공정을 도입하는 연구를 수행하였다. 배양 환경 요소 중 가장 중요하다고 알려진 온도를 최적화 시킴과 동시에 배양 첨가물의 종류와 농도를 최적화 시키는 연구를 flask 와 bioreactor scale에서 함께 수행하였다. Fc-fusion protein을 생산하는 두 종류의 CHO 세포주를 사용하였으며, 최적화된 유가식 배양 공정은 회분식 배양에 비해 7일 이상의 배양 기간 연장과 2배 정도의 최대 세포수를 보였다. 결과적으로 4 ~ 5배 이상의 최종 Fc-fusion protein의 생산성의 증가를 보여주었다.
치료용 단백질의 생산성을 높이기 위한 또 다른 방법으로 $glycogen synthase kinase-3\beta$ ($GSK-3\beta$)의 저해제로 잘 알려진 LiCl을 배양 첨가물로 사용하였다. Fc-fusion protein을 생산하는 두 종류의 CHO 세포주를 사용하였으며, 다양한 농도의 LiCl을 첨가하여 flask scale에서 그 반응을 관찰하였다. 두 세포주에서 모두 LiCl이 첨가되는 농도가 증가함에 따라 세포의 성장이 억제 되었지만 그와 동시에 비 생산 속도가 크게 증가하는 것을 확인하였다. 생산성을 최대로 증가 시키는 LiCl의 농도는 10mM 이었으며, 이를 bioreactor scale에서 재현해 보았다. 결과는 flask scale에서와 비슷한 경향을 나타내었으며, 최종적으로 2배 이상의 최대 생산성이 증가하는 것을 관찰하였다. 세포의 성장이 억제되는 것은 cell cycle과 관련이 있기 때문에 flow cytometeric analysis 를 통해 패턴을 분석하였으며, LiCl의 첨가가 G2/M phase에서 cell cycle을 억제 시키는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 LiCl에 의한 $GSK-3\beta$ 의 억제는 항 세포 예정사 효과가 있다는 것도 관찰하였다. LiCl이 첨가된 조건에서 배양 후반부에 Bcl-2의 발현이 증가하는 것을 확인하였으며, 이에 따라 세포 예정사의 마커인 cleaved caspase-3/7 and cleaved-PARP의 발현량이 줄어는 것을 확인하였다. 즉, 배양 첨가물로써 LiCl은 G2/M cell cycle 억제와 세포 예정사의 억제를 통해 효과적으로 Fc-fusion protein의 생산성을 높이는 역할을 할 수 있으며, 산업적으로 이용 가치가 크다고 볼 수 있다.
결론적으로, 시알산화는 배지에 축적되는 암모니아에 의해 크게 감소하며 이는 neu1과 neu3의 억제 또는 글루타민을 $\alpha-KG$ 로 대체하는 것을 통해 극복할 수 있다. 생산성을 극대화 시키기 위해서 유가식 배양 공정은 매우 효과적인 방법이며, LiCl의 첨가를 통해 추가적인 생산성의 증가를 얻을 수 있다.
