Part I. REX1 positively contributes to the maintenance of hPSC self-renewal and pluripotency
Transcription factor REX1 is widely used as a stem cell marker, but its functions remain poorly understood. Here, we show that REX1 is an essential factor for the maintenance and the full differentiation potential of human embryonic stem cells (hESCs). Depletion of REX1 in hESCs leads to differentiation, reduced potential for mesoderm fate in vivo, growth inhibition, apoptosis and G2 arrest. Cyclin B1/B2 expression was found to parallel that of REX1. REX1 binds to cyclin B1/B2 promoters and regulates their transcriptional activity. REX1 induces the phosphorylation of Drp1 at Ser616 by cyclin B/CDK1, which leads to mitochondrial fission. REX1 contributes to a distinctive metabolic feature of highly glycolytic hESCs through promoting Drp1 fission activity; whereas upon REX1 depletion, there are changes into an elongated mitochondrial network within hESCs. These findings reveal a functional role for REX1 in the maintenance of stem cell pluripotency.
Part II. REX1 is an essential factor for the rapid and efficient reprogramming of human somatic cells into a pluripotent state
Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be reprogrammed from a variety of somatic cells using different combinations of defined factors. To date, however, there are several hurdles in this process, such as safety issues and low efficiency. Intrinsic REX1 is indispensable for reprogramming human somatic cells to pluripotency, and ectopic REX1 is beneficial for enhancing reprogramming efficiency and kinetics. REX1 facilitates the reprogramming process by enhancing cyclin B expression and Drp1 fission activity, affecting pluripotency. We also report that the REX1 can be employed to produce hiPSCs from various cell types without cell type-specific restrictions and can reduce the number of required reprogramming factors. Human neural progenitors and mesenchymal stem cells were efficiently and rapidly reprogrammed into hiPSCs using combinations of two (REX1 and OCT4) and three (REX1, OCT4, and SOX2) non-oncogenic factors, respectively. Our results highlight the crucial role of REX1 as a pro-reprogramming factor in making safer hiPSCs in a simpler and more efficient manner relative to the current protocol.
REX1은 전분화능을 가진 세포에서 특이적으로 발현되며, 인간배아줄기세포 및 유도만능 줄기세포에서의 초기 분화를 매우 민감하게 감지할 수 있는 미분화 마커로써 널리 사용되고 있다. 하지만, 인간 배아줄기세포 및 인간 유도만능 줄기세포의 전분화능의 유지 및 획득과 관련된 REX1에 의한 세포-분자적 기전은 명확히 알려져 있지 않다. REX1의 전분화능 유지 및 역분화를 통한 다분화능 획득 제어 기전을 이해하기 위해서, 렌티바이러스에 의한 shRNA 전달 시스템을 이용하여 REX1발현 억제 인간 배아줄기세포주를 확립하였다. REX1 발현 억제 세포주에서는 세포 분화가 진행되고, 특히 중간엽 계통으로의 분화능이 감소되어 있었다. 또한 REX1 발현 억제에 의해 세포들은 세포 성장이 억제되며, 세포사멸이 증가하고, G2기에 정지되었다. G2/M 진행 관련 중심 조절자인 cyclin B1 및 B2의 발현은 REX1의 발현 양상과 상관관계를 보여주었는데, 염색질 면역침강법 및 프로모터 활성 변화 분석을 통해 REX1이cyclin B1 및 B2의 발현을 조절될 수 있음을 증명하였다. 또한 REX1은 cyclin B1 및 B2의 발현 조절을 통해서 Drp1의 Ser616의 인산화를 증가시킴으로써 인간 다능성 줄기세포 내의 마이토콘드리아 분열(fission)을 촉진하고, glycolytic 특성을 유지하였다.
다분화능에 기능을 하는 전사인자들 (Oct4, Sox2, Klf4, cMyc)의 복합적인 과발현에 의한 역분화 유도 기술이 개발됨에 따라 체세포로부터 인간 배아줄기세포와 유사한 특성을 가지는 유도만능줄기세포의 제조가 가능하게 되었다. 이를 통해, 환자-체세포로부터 맞춤형 자가 전분화능 줄기세포주를 확립할 수 있는 가능성을 제공하고, 인간 배아줄기세포 이용 시 야기될 수 있는 생명윤리 논란 및 면역 적합성 문제를 극복할 수 있는 최적의 해법으로 인식되면서 미래 재생의료 기술 개발 분야에 무한한 가능성을 제시하고 있다. 하지만, 역분화 기술의 우수성에도 불구하고, 이를 세포치료제 및 신약 개발 단계에 활용하기 위해서는 낮은 역분화 효율, 역분화 과정에 소요되는 긴 시간 프레임, 암유전자 및 바이러스 벡터 사용 등의 문제점들을 해결해야 한다. 따라서, 본 연구를 통해 REX1이 암 발생 가능성이 있는 기존 인자의 기능을 대체하고, 역분화 효율을 획기적으로 개선할 수 있는 새로운 역분화 인자로써의 이용 가능성을 확인하고, 이와 연관된 역분화를 통한 다분화능 획득 기작을 규명하고자 하였다. 인간 섬유아체세포를 유도만능줄기세포로 역분화 유도하는 과정에서 REX1 전사인자를 사용한 경우에 역분화 효율이 효과적으로 증진되고, 역분화에 소요되는 시간을 단축시키며, 기존의 역분화 인자인 KLF4를 대체할 수 있었다. 또한, 역분화 줄기세포를 확립하기 위한 효율성과 접근성이 높은 세포 자원으로 알려진 인간 신경전구세포와 인간 중간엽줄기세포를 이용한 역분화 과정에서도 REX1에 의한 역분화 개선 효과가 유사하게 나타남을 확인함으로써, REX1이 계통-특이적인 제한이 없이, 다양한 분화 세포의 역분화에 이용될 수 있음을 확인하였다. 이러한 REX1을 이용하여 생산된 유도만능줄기세포는 인간 배아줄기세포와 같은 다분화능 특성을 보존하고 있었다. 특히, REX1을 역분화 인자로 사용한 경우, 역분화 과정 동안 REX1의 목표 유전자인 cyclin B1 및 B2 발현량이 유의성 있게 증가되었다. 결론적으로, 본 연구를 통해 REX1을 범용 역분화 인자로서 활용될 수 있음을 확인하였고, 이러한 REX1의 기능은 cyclin B1 및 B2 발현을 조절함으로써 기존 역분화 유도 과정에서 발생하는 세포주기 정지 및 세포 증식 억제 현상을 개선하고, 마이토콘드리아 분열 및 glycolytic metabolism으로의 전환을 촉진함으로써 역분화 효율을 높일 수 있음을 증명하였다.
인간 배아줄기세포 및 유도만능 줄기세포의 세포치료, 신약 개발 및 조직공학 등의 재생의학 분야의 활용을 위해서는 전분화능 분자적 제어 기전의 이해가 선행되어야 한다. 따라서 REX1이 기능적으로 전분화능 유지에 기여하고, 전분화능과 역분화의 조절 인자로 작용할 수 있음을 증명한 본 연구를 통해서 인간 다능성줄기세포의 기초 분야 및 임상 분야의 활용성을 증대시킬 수 있을 것이며, 맞춤형 줄기세포 세포치료제 개발 및 신약개발 등의 분야에 기여할 수 있을 것이다.
