First, the extracellular proteome of E. coli BL21(DE3) in high cell density cultivation was firstly profiled and compared with that of E. coli W3110. These data could be useful for the study of excretion mechanism of nonpathogenic E. coli and applied for the fusion target identification in extracellular recombinant proteins production.
Second, based on the above study, a new system was established for high-level extracellular production of recombinant proteins in E. coli. The best excreting fusion partner, OsmY, was identified and used as a carrier protein to excrete heterologous proteins into the culture medium. Model proteins including E. coli alkaline phosphatase, Bacillus subtilis α-amylase, and human leptin could all be excreted into the medium at concentrations ranging from 5 to 64 mg/L during the flask cultivation.
Third, based on comparative proteomic analysis, a platform was developed for high-level cytoplasmic production of spider silk proteins in E. coli. To get a global view of the responses upon silk protein production, the whole proteomes of silk protein-producing cells were profiled. The comparative proteomic analysis implied that intracellular glycyl-tRNA pool probably limited the production of the silk proteins. Therefore, measures were taken to increase glycine tRNA levels by coexpression of the glycine tRNA genes (glyVXY), and increase glycine availability by coexpression of the glycine biosynthetic gene (glyA) and inactivation of the glycine cleavage system. Severalfold increase was thus achieved in the production of the silk proteins, ranging from ~100 to 300 kDa.
These findings may be potentially useful for the large-scale production of recombinant proteins in E. coli.
첫째, 고농도 배양에서 E. coli BL21(DE3)의 세포 밖 단백질체를 최초로 분석하고 E. coli W3110와 비교하였다. 이러한 단백질체 정보는 비 병원성 대장균의 분비 메커니즘 연구에 유용하게 사용될 수 있으며 세포 밖 재조합 단백질 생산에 있어서 융합 타깃 규명에 응용될 수 있다.
둘째, 위 연구를 기반으로 대장균을 이용하여 재조합 단백질을 세포 밖으로 분비시켜 생산할 수 있는 새로운 시스템을 획득하였다. 가장 좋은 분비 융합 파트너로서 OsmY를 규명하였으며, 배양액으로 이종 단백질을 분비시키기 위한 운반 단백질로서 사용하였다. 대표적인 예로서 OsmY를 이용하여 대장균의 알칼리 포스파타아제와 Bacillus subtilis의 α-아밀라아제, 인간 렙틴 등 각각의 단백질을 플라스크 배양을 통해 5 ~ 64 mg/L 농도로 배양액으로 분비시켰다.
셋째, 비교 단백질체 분석을 바탕으로 대장균 세포 내에서 거미의 실크 단백질을 고농도로 생산할 수 있는 기반 기술을 개발하였다. 실크 단백질 생산에 대한 전반적 반응을 연구하기 위해 실크 단백질 생산 세포의 전체 단백질체를 분석하였고 비교 단백질체 분석을 통해 세포간 glycyl-tRNA가 실크 단백질 생산에 있어서 제약요인이 될 수 있음을 추정하였다. 따라서 글리신 tRNA 농도를 높이기 위해 글리신 tRNA 유전자(glyVXY)를 실크 단백질과 함께 발현시켰고, 글리신 이용가능성을 높이기 위해 글리신 합성 유전자인 glyA 또한 동시에 발현시키고 글리신 분해 시스템을 비활성화하였다.
결과적으로 약 100 ~ 300kDa의 실크 단백질 생산을 약 7배까지 증가시키는데 성공하였다.
이러한 연구는 앞으로 대장균을 이용한 재조합 단백질 대량 생산에 유용하게 이용될 것이다.
