Phototropins belongs to the class of blue light activated protein kinases which are essential for phototropism in plants. Phototropin has two chromophoric domains named light-oxygen-voltage- sensing LOV1 and LOV2 in the N-terminal and a serine/threonine (Ser/Thr) protein kinase motif in the C-terminal connected by Jα helix. These domains bind to flavin chromophore and form a FMN-Cys photoadduct as part of light sensing process and make the Jα helix to unfold followed by activation of kinase domain. It remains unclear so far that how the signal is transmitted to the kinase domain from the LOV2 core at atomic level.To study the conformational changes of protein in the native aqueous environment is a challenging task.
In this work, we have employed picosecond X-ray solution scattering and novel structural analysis to track the details of the structural dynamics of I427V mutant of LOV2 over time range from 10 us to 10 sec, since it has quick recovery time scale of about 5 sec that is suitable for the time resolved X-ray scattering techniques in order to study the folding dynamics. Moreover, we will track the intermediates that form during the reaction pathway of wild type LOV2 at molecular level. Also, we are trying to design novel photoreceptors using LOV2 domain and to study the signal propagation from the sensory domain to the DNA binding domain (RAC1) by using Transient grating techniques, as it has wide application in optogenetic studies. Also bacterial photoreceptor proteins like BlrB and AppA was also cloned in pET15b vector and expressed well in BL21DE3 cell line for TR-WAXS and TG studies.
포토트로핀(Phototropin)은 식물의 굴광성과 관련되는 청색 광 활성 단백질 인산화 효소의 한 종류이다. 포토트로핀은 두 영역의 발색단을 갖는데 하나는 LOV1과 LOV2로 일컬어지며 질소 말단에 위치해있고, 다른 하나는 세린/트레오닌 단백질 인산화 효소 부분으로 탄소 말단에 위치해있다. 두 부분은 서로 Jα 나선으로 연결되어 있다. 이들 영역은 플라빈(flavin) 발색단에 결합하여 광각 현상의 일부로써 FMN-Cys 광생성물을 형성하며 Jα 나선을 풀어지게(unfold) 하여 인산화 효소 영역을 활성화 시킨다. 이 과정에서 신호가 어떻게 LOV2 코어에서 인산화 효소 영역으로 전달되는지에 관해서는 원자수준에서 명확히 밝혀진 바가 없다. 특히, 단백질의 구조 변화를 본래의 용액상 환경에서 관찰하는 것에는 더욱 어려움이 따른다.
본 연구에서는 피코초 X-선 액상 산란과 구조 분석법을 이용하여 LOV2 단백질의 I427V 돌연변이체에 대한 구조동역학 관찰을 수행하였다. LOV2 단백질의 광반응을 야기하여 10μs에서부터 10s에 이르는 시간을 관찰하였으며, 반응 시작점으로부터 본래의 상태로 회복되기까지 걸리는 시간이 5s정도로 이는 X-선 액상 산란법을 이용한 단백질 접힘 동역학의 관찰에 적합하다. 일련의 시간 동안 생성되는 중간체들을 분석함으로써 분자 수준에서 LOV2 단백질의 반응경로를 추적하였다. 또한 LOV2 영역을 이용한 새로운 광수용체를 디자인하여 과도 회절 격자법(transient grating technique, TG)을 통해 감각 수용기로부터 DNA 결합 영역(RAC1)까지의 신호 전달 과정에 대한 연구를 진행하였다. 마지막으로 BlrB와 AppA와 같은 세균성 광수용체 단백질에 대한 시간 분해 광각 X-선 산란 및 TG 연구를 위하여 이들을 pET15b 벡터로부터 복제한 후 BL21DE3 셀 라인(cell line)에서 발현시켰다.
