Colorimetric sensors, which transform the detection events into color changes, possess a lot of advantages in terms of the naked eye detection, simplicity, no requirement of sophisticated instruments, cost-effectiveness, and easiness of analysis. The development of highly sensitive and selective colorimetric sensors has been a major goal in many fields including disease diagnostics, environmental monitoring, food safety assessment, and forensic science. Nanoparticles of gold and silver have been extensively utilized for the development of colorimetric biosensors owing to their unique optical properties. In this regard, regulation of the metal ions reduction can be utilized to develop new biosensors since it modulates the synthesis of nanoparticles which give a colorimetric signal. By controlling the reduction of novel metal ions, we have developed various colorimetric sensors for the detection of nucleic acids, amino acids, and enzymatic activity.
In the first strategy described in chapter 2, a label-free, colorimetric method for ultrasensitive detection of nucleic acids, which is based on photoinduced silver ion (Ag+) reduction by DNA bases, has been developed. In the assay procedure, Ag+ is first allowed to bind to DNA through interactions with its nucleobases. The resulting DNA-Ag+ complex is then photoirradiated with 254 nm UV light, which leads to the reduction of Ag+. This process generates silver nanoparticles (AgNPs) through silver nucleation and deposition around the DNA and gives rise to a visually detectable color change with concomitant formation of an absorption peak at ca. 420 nm. The analytical capability of this simple but very powerful methodology was successfully verified by its use in the direct detection of unamplified genomic DNA from a Salmonella typhimurium pathogen with an ultrahigh sensitivity down to 67 pg/μL. The new assay system greatly simplifies and accelerates the procedure for detecting nucleic acids because it does not require a preliminary amplification process, a long sought after goal in the fields of molecular diagnostics and genetic analysis.
In chapter 3, a label-free colorimetric method for detection of thiol group-containing biomolecules (biothiols) was developed based on photoinduced gold ions (Au(III)) reduction in the presence of amino acid. The strategy relies on the inhibition effect of biothiols which are strongly attached to Au(III) via gold-thiol interaction against gold nanoparticles (AuNPs) synthesis. Au(III) are first incubated with the solutions containing amino acids and then exposed to 254 nm UV light. It leads to Au(III) reduction followed by AuNPs growth which is the process catalyzed by amino acids and gives a visually detectable color change of the solutions to red with a concomitant absorption peak at ca. 530 nm. On the contrary, in the presence of biothiols, Au(III) would not undergo the reduction process because Au(III) bind to the thiol moiety of biothiols by strong Au-thiol interaction and it prevents reduction of Au(III) to Au(0). As a result, the color of the solutions containing biothiols remains colorless even after UV irradiation enabling the naked eye discrimination from the solutions containing common amino acids. The detection strategy based on this interesting phenomenon exhibited a high selectivity over common amino acids and was successfully applied to the determination of biothiols in human plasma. It suggests our proposed method has a great potential for diagnostic applications in a simple and homogeneous manner.
Furthermore, we have extended our previous strategy for biothiols detection by devising a novel method for target nucleic acids detection that incorporates α-phosphorothioate deoxynucleotide (dNTPαS) during the polymerization process as described in chapter 4. The first step involves PCR amplification of a target DNA sequence with dNTPαS. They are incorporated into target template by a polymerase reaction and form phosphorothioate internucleotide linkage PCR product. When mixed with Au(III), the DNA strands of the PCR product bind to Au(III) as a result of the strong interaction that takes place between sulfur at α-phosphate and Au(III). The mixture solutions are then irradiated by 254 nm wavelength of UV light in the presence of Thr which act as a catalyst for Au(III) reduction process. In this case, Au(III) could not be reduced by UV irradiation since Au(III) bind to sulfur in phosphorothioate PCR product and it blocks a reduction of them to AuNPs, leaving the solution as a colorless state. In contrast, in the case where a target DNA sequence is not included and amplification does not take place, dNTPαS would remain unincorporated. Therefore, after removal of unreacted reagents by purification procedure, free Au(III) can be reduced to Au(0) and form AuNPs by UV irradiation. As a result, we can colorimetrically detect target nucleic acids with the naked eye by monitoring the color change of the samples. Not requiring sophisticated detection instrumentation or complicated manipulations including surface modification of AuNPs or precise control of temperature and salt concentration, this novel strategy allows us to identify PCR-amplified target nucleic acids reliably and in a very convenient manner.
Finally, we have developed a simple colorimetric method for selective determination of the DNase Ι activity utilizing phosphorothioate DNA probe as described in chapter 5. The inhibition of photoinduced AuNPs synthesis induced by sulfur in phosphorothioate DNA probe was employed for assaying DNase Ι activity for the first time. In the presence of DNase Ι, DNA probe is cleaved into tetra- or smaller oligonucleotides by DNase Ι action and the cleaved fragments are removed by purification process. After colorimetric assay using HAuCl4 and Thr followed by UV irradiation, colorimetric signals are generated to determine DNase Ι activity. The assay can be easily analyzed by monitoring the color change of the samples from colorless to red with the naked eye in signal-on manner. The clinical utility of this simple, yet highly efficient colorimetric strategy was successfully verified by quantifying DNase Ι activity in bovine urine sample. Therefore, the present study opens up a new possibility for the rapid, convenient, and cost-effective determination of DNase Ι activity in practical applications.
발색 센서란 검출 결과를 색 변화로 변환시키는 것으로써, 간편함, 분석의 용이성, 경제성 등의 측면에서 많은 장점을 가진다. 민감도와 특이성이 높은 발색 센서를 개발하는 것은 그동안 질병 진단, 환경 모니터링, 식품 안전성 평가, 법의학 등을 포함한 많은 분야에서 주요한 목표 중의 하나로 여겨져 왔다. 그 중에서도 금속 나노입자는 특유의 광학적 특성으로 인해 금과 은 나노입자를 이용한 바이오물질의 발색 진단 센서들이 많이 개발되어 왔다. 이러한 관점에서 금속 이온의 환원을 조절하는 것은 금속 나노입자의 생성을 유도하여 발색 신호를 얻을 수 있기 때문에 발색 진단 센서를 개발 하는데 유용하게 활용될 수 있다. 본 연구에서는 금속 이온의 환원을 조절함으로써 DNA, 아미노산 및 효소 활성을 진단할 수 있는 다양한 발색 진단 기술들을 개발하였다.
먼저 제 2장에서는 DNA의 존재 하에서 자외선 조사를 통해 은 이온을 환원시킴으로써 DNA를 높은 민감도로 검출하는 비표지 발색 진단 방법을 개발하였다. 은 이온은 DNA의 염기와 반응하여 안정적인 복합체를 형성한다. 여기에 254 nm 파장의 자외선을 조사하면 DNA 염기의 산화와 동시에 DNA에 결합해 있는 은 이온의 환원이 일어나게 된다. 이러한 과정을 통해 DNA 주위에 은 나노입자들이 형성되게 되고, 형성된 은 나노입자들은 약 420 nm에서 최대 흡광 성질을 갖기 때문에 샘플 용액의 색 변화를 관찰할 수 있게 된다. 특히 본 방법은 증폭 과정 없이 길이가 긴 박테리아의 genomic DNA를 검출 및 정량하는 데 이용될 수 있는 장점을 가진다. 실제 살모넬라 병원균으로부터 추출한, 증폭하지 않은 genomic DNA 검출에 본 방법을 적용하여 67 pg/μL의 농도까지 검출이 가능한 것을 확인하였다. 본 기술은 높은 민감도로 인해 유전자 진단 분야에서 사전 증폭 과정을 없앨 수 있기 때문에 큰 장점을 가진다고 할 수 있다.
제 3장에서는 아미노산의 존재 하에서 자외선 조사를 통해 금 이온을 환원시킴으로써 생물학적 티올 (biological thiol)을 비표지 방식으로 검출하는 방법을 개발하였다. 본 방법은 생물학적 티올 의 티올 (thiol) 그룹이 금 이온과 특이적으로 결합하여 금 나노입자 형성을 억제시키는 현상에 기인한다. 일반 아미노산이 들어있는 용액의 경우 금 이온을 넣어준 후 자외선을 조사시키면 아미노산이 촉매제 역할을 함으로써 금 이온의 환원이 일어나 금 나노입자를 형성하게 되고, 따라서 약 530 nm파장에서 흡광도를 가지며 용액의 색을 붉은 색으로 변화시킨다. 반면에 생물학적 티올의 경우 티올 그룹이 금 이온과 결합하여 금 이온의 환원을 방해하기 때문에 금 나노입자가 생성되지 않게 되어 자외선 조사 후에도 용액의 색이 무색으로 남아있게 된다. 따라서 일반 아미노산과 생물학적 티올의 구별이 용액의 색 변화 차이로 가능하게 된다. 실제 인체의 혈장 내에 존재하는 생물학적 티올을 검출하는 데 본 방법이 성공적으로 적용되었다. 따라서 본 기술은 매우 간편한 방식으로 실제 임상 진단에 활용될 수 있을 것이다.
제 4장에서는 티올과 금 이온의 결합으로 인한 금 이온의 환원 억제 현상을 이용하여 표적 유전자를 발색 진단하는 새로운 방법을 개발하였다. 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 dNTP의 유사 물질인 α-phosphorothioate deoxynucleotide (dNTPαS)를 이용하여 phosphorothioate 결합을 가지는 PCR 증폭 산물이 생성되도록 디자인 하였다. dNTPαS란 α-phosphate 자리의 산소(O)가 황(S)으로 치환된 dNTP로서, DNA 중합반응에 사용될 경우phosphorothioate 결합을 가지는 DNA 가닥을 형성하게 된다. 따라서 이들을 금 이온과 반응시키면 앞에서와 마찬가지로 황과 금 이온의 결합으로 인해 금 이온의 환원이 저해된다. 반면에 표적 유전자가 존재하지 않는 경우에는 PCR이 일어나지 않기 때문에 dNTPαS가 중합되지 않게 되고, 따라서 반응하지 않은 물질들을 제거한 뒤 금 이온의 환원을 수행하면 자유로운 금 이온들이 환원되어 금 나노입자를 형성시킨다. 따라서 표적 유전자의 존재 유무를 샘플 용액의 색 변화 차이로 진단해 낼 수 있었다. 특별한 분석 기기나 금 나노입자 표면의 표지 과정이 필요 없기 때문에 본 방법은 PCR 증폭된 유전자를 간편한 방식으로 검출해 낼 수 있다. 실제 살모넬라 균의 PCR 증폭 산물을 검출하는 데 본 방법이 성공적으로 적용되었다.
마지막으로 제 5장에서는 앞에서의 연구를 확장하여phosphorothioate 결합을 가지는DNA 탐침 (PS DNA probe)을 이용하여DNA 분해 효소인 DNase Ι 의 활성을 측정하는 방법을 개발하였다. DNase Ι의 활성이 있는 경우 PS DNA probe는 매우 작은 올리고뉴클레오티드 단편으로 잘려지게 되고, 이러한 단편 조각들을 제거한 후에 금 이온의 환원 반응을 수행하면 자유로운 금 이온들이 환원되어 금 나노입자를 형성한다. 따라서 분석하고자 하는 샘플 용액의 색 변화를 측정함으로써 DNase Ι의 활성 여부를 분석해 낼 수 있었다. 실제 소변 샘플에 존재하는 DNase Ι을 성공적으로 분석해 냄으로써 임상 적용 가능성을 확인하였다. 비록 잘려진 올리고뉴클레오티드 단편의 정제 과정이 필요하더라도, 이는 10 분 이내에 매우 손쉽게 수행될 수 있기 때문에 본 방법을 통해 쉽고 빠른 DNase Ι 활성 측정이 가능할 것으로 기대된다.
