The pluripotency of embryonic stem cells (ESCs) is maintained by intracellular networks of many pluripotency-associated (PA) proteins such as OCT4, SOX2, and NANOG. However, the mechanisms underlying the regulation of protein homeostasis for pluripotency remain elusive. Here, we first demonstrate that autophagy acts together with the ubiquitin-proteasome system (UPS) to modulate the levels of PA proteins in human ESCs (hESCs). Autophagy inhibition impaired the pluripotency despite increment of PA proteins in hESCs. Immunogold-electron microscopy confirmed localization of OCT4 molecules within autophagosomes. Also, knockdown of LC3 expression led to accumulation of PA proteins and reduction of pluripotency in hESCs. Interestingly, autophagy and the UPS showed differential kinetics in the degradation of PA proteins. Autophagy inhibition caused enhanced accumulation of both cytoplasmic and nuclear PA proteins whereas the UPS inhibition led to preferentially degrade nuclear PA proteins. Our findings suggest that autophagy modulates homeostasis of PA proteins, providing a new insight in the regulation of pluripotency in hESCs.
인간배아줄기세포의 전능성은 인간배아줄기세포에서 특이적으로 발현되는 OCT4, SOX2, NANOG 단백질 등의 양적인 균형과 이러한 전능성 조절 단백질들의 상호 간의 긴밀한 피드백 작용, 네트워크 등에 의해 정교하게 유지되고 있다. 그러나 실제로 인간배아줄기세포에서 전능성 조절 단백질들의 양적 조절과 상호 관계가 어떠한 메커니즘에 의해 유지되고, 결과적으로 인간배아줄기세포 고유의 전능성이 유지되는가에 관한 연구는 현재까지 보고된 바가 매우 드물다. 이러한 점에 착안하여, 본 연구에서는 인간배아줄기세포 의 전능성 조절 단백질들의 분해 기작에 관련한 연구를 수행하였다.
일반적으로 세포가 건강한 대사를 유지하고 그 특성을 원활하게 나타내며, 또한 성장해 나가기 위해서는 세포 유지에 필수적인 단백질들의 분해와 그에 해당하는 생성작용이 끊임없이 일어나야 하며, 그러한 양적인 상관 관계에 따른 균형이 깨어져서는 안 된다. 인간배아 줄기세포 역시, 인간배아줄기세포 고유의 전능성과 또한 전능성을 이루면서 쉼 없이 분열할 수 있는 능력을 갖추기 위해서는 세포의 특이성을 유지하는 데 필수적인 단백질들 (특별히, OCT4, SOX2, NANOG 등)의 양적인 항상성 유지가 필수적이라고 할 수 있다. 이러한 단백질들이 어떠한 조절 메커니즘에 의해 분해 되는가에 관한 연구는 유비퀴틴-프로테아좀 기작에 의한 것이라는 보고가 있었다. 세포 내에서 일어나는 단백질 분해 기작은 크게 두 가지로 나누어 볼 수 있는데, 그 중 하나가 유비퀴틴-프로테아좀에 의한 분해이고, 또 다른 메커니즘으로 존재하는 것이 오토파지에 의한 분해작용이다.
본 연구의 또 다른 큰 방향은 단백질 분해 기작인 오토파지가 인간배아 줄기세포에서 어떻게 일어나고 있고, 인간배아줄기세포의 전능성을 유지하기 위한 항성성 유지와는 어떠한 관계가 있는가에 대한 것이다. 본 연구 결과에 따르면, 인간배아 줄기세포에서 오토파지를 억제하였을 경우 (화학적 접근, 유전자적 접근 모두), 기존의 세포 내에 오토파지 활성에 의해 분해되었던 배아줄기세포 전능성 조절 단백질들이 다량으로 축적되며, 이로 인해 다량의 단백질들이 실험적으로 검출 되는 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도, 세포 내에 배아줄기세포 전능성 조절 단백질들이 다량 검출되었음에도 불구하고, 전체적인 배아줄기세포 특이적 성질을 나타내는 막 특이 단백질들인 SSEA4, TRA1-60, TRA1-81 등은 급속하게 감소함으로 인해, 세포 내의 줄기세포 전능성 조절 단백질들의 균형의 깨짐으로 인간배아줄기세포가 그 특이적 성질을 나타내지 못하는 것으로 또한 보여졌다. 인간배아줄기세포에서 대표적인 단백질 OCT4와 오토파고좀의 세포 내 위치가 동일하게 발견되고, 이 사실을 전자면역현미경법적 접근으로 재증명해 본 결과 정확한 오토파고좀 구조체 내에 다량의 OCT4 단백질이 함유되어 있는 것이 최종 확인되었다.
이러한 사실을 바탕으로, 본 연구에서는 기존에 이러한 인간배아줄기세포 전능성 조절 단백질들을 분해한다고 잘 알려진 유비퀴틴-프로테아좀 분해 기작과 오토파지에 의한 분해 기작을 비교 분석하였다. 실제 인간배아줄기세포 배양 조건에서, 배양 중에던 배지를 새로운 배지로 바꾸어 주게 되면, 다량의 영양 요소가 동시적으로 세포 내에 유입되게 되는데, 이러한 상황은 배아줄기세포 전능성 조절 단백질들의 과도한 합성을 유도하고, 이러한 세포 내 환경은 인간배아줄기세포의 특유의 항상성을 유지하는 데 제거되어야 할 대상으로써 작용한다. 따라서 항상성 유지를 저해시키는 요소를 완화하기 위해 줄기세포는 유비퀴틴-프로테아좀 분해기작을 먼저 작동시키고, 또한 연속적으로 오토파지에 의한 기작을 동시에 활성화 시킴으로, 갑작스러운 줄기세포 전능성 조절 단백질들의 과합성으로 인한 상황을 해결하도록 돕는다. 배양 시간이 늘어남에 따라 생기는 비호의적인 부산물들의 제거를 위해서는 오토파지 메커니즘을 작동시킴으로 인해 세포 내 불필요하거나 제거되어야 할 단백질들의 제거를 담당시킨다. 오토파지는 또한 유비퀴틴-프로테아좀 기작과는 달리, 세포질에 존재하는 배아줄기세포 전능성 조절 단백질들의 분해에 더 직접적으로 연관되어 있다는 것이 또한 본 연구에 의해 밝혀졌다. 이러한 결과는 두 분해 기작이 동역학적으로 서로 다른 방식을 취한다는 것을 말한다. 종합적으로, 오토파지 분해 기작은 아마도 유비퀴틴-프로테아좀에 의한 분해 기작과 함께 상호 협동적으로 인간배아줄기세포 전능성 조절 단백질들의 항상성 유지를 돕는다는 가설이 제시되었으며, 이것은 인간배아줄기세포의 전능성 유지 조절 메커니즘을 연구하는 데에 새로운 이해를 제공할 것이다.
