The interaction of photons with biological tissue results in scattering, reflection, transmission, and absorption. Absorption of photon energy by cells or tissue can evoke photothermal, photomechanical, and photochemical effects, depending on the density of the deposited energy. The femtosecond-pulsed lasers have a high intensity due to the short pulse duration, despite its low average energy. Through nonlinear absorption, femtosecond-pulsed lasers can deliver very high peak energy into the submicron focus area without causing collateral damage. Recently, there have been many reports that femtosecond-pulsed laser can modulate intracellular Ca2+ concentration or biological functions, however the molecular mechanisms are still unclear. In this project, I investigated femtosecond laser-induced cell signaling how femtosecond laser occurs intracellular Ca2+ increases and modulates biological functions at tissue scale. I also performed analysis of femtosecond laser-induced cytotoxicity and its application.
After brief introduction of this thesis and recent biological applications of femtosecond laser in chapter 1, I investigated mechanisms of femtosecond laser-induced intracellular Ca2+ increase and propagation in mice urinary smooth muscle tissue and cells in chapter 2. Focused femtosecond-pulsed laser irradiation using high numerical aperture objective lens induces a bunch of free electron, which can be readily converted to reactive oxygen species (ROS) and related free radicals in the localized region. I showed that laser-induced ROS are involved in initial step of Ca2+ releasing from endoplasmic reticulum. Locally increased intracellular Ca2+ levels are amplified by calcium-induced calcium releasing mechanisms through the ryanodine receptor, a Ca2+ channel of the endoplasmic reticulum. The laser-induced Ca2+ increases propagate to adjacent cells through gap junctions. Thus, femtosecond-pulsed lasers can induce smooth muscle contraction by controlling Ca2+, even with optical stimulation of the diffraction-limited volume.
In chapter 3, I performed analysis of femtosecond laser-induced cytotoxicity. Low concentration of laser-induced ROS modulates biological functions, but laser-induced ROS above the threshold concentration induce cytotoxic effects. The irradiated cell showed mitochondrial fragmentation, rapid plasma membrane retraction and bleb formation, and minimal loss of membrane integrity in vitro. Although laser-induced cell death is occurred within several minutes, this type of cell death is similar to apoptosis rather than necrosis. I found that laser-induced ROS are involved in laser-induced cell death. Through mitochondrial dynamics study, I found that laser-induced cell death is mediated by ROS regulatory function of mitochondria.
In conclusion, these two studies of femtosecond laser-induced cell signaling, one for mechanisms of laser-induced Ca2+ increase and propagation and the other for laser-induced cytotoxicity and its application, may play valuable roles in development biomedical optic tools using femtosecond lasers.
빛은 생체조직과 반응하여 전달되는 에너지에 따라 광열, 광물리, 광화학 효과를 일으킬 수 있다. 펨토초 레이저는 펄스 하나의 지속시간이 수백 펨토초 (10-15초) 정도로 매우 짧아 평균 에너지는 낮게 유지하며 순간적으로 매우 높은 빛 강도를 가질 수 있어 광열 효과 없이 광물리, 광화학 효과를 일으킬 수 있다. 최근 펨토초 레이저에 의해 세포 내 칼슘 농도를 조절하거나 생체기능을 조절하는 연구가 많이 보고되었다. 본 논문에서는 펨토초 레이저에 의해 유발된 저밀도 플라즈마 (1023 전자/cm3 이하)가 일으키는 세포 신호전달 및 조직에 주는 영향을 연구하였다.
첫 번째 장에서는 본 논문에 관한 개괄적인 소개 및 최근 이루어진 펨토초 레이저에 의한 생체기능 조절 연구를 소개하였다. 두 번째 장에서는 광독성을 일으키지 않는 범위의 레이저 자극에서 일어나는 칼슘 증가의 원인 및 조직 전체의 수축을 유도하는 신호전달 체계를 규명하였다. 본 연구에서 높은 개구수에 의해 초점이 모인 펨토초 레이저가 활성산소종을 생성하고, 이 활성산소종이 세포 내 칼슘 증가의 시작단계에 필요하다는 것을 밝혔다. 활성산소종에 의해 국소적으로 증가된 칼슘은 소포체의 칼슘에 의한 칼슘 방출 (Calcium-induced Calcium Release) 과정을 통해 세포 전체의 칼슘 농도가 증가한다. 이때 소포체 칼슘채널인 리아도닌 수용체 (Ryanodine receptor)가 관여하고, 이노시톨-1,4,5-트리스인산수용체 (IP3 receptor)는 관여하지 않는 것을 밝혔다. 세포 전체에 증가된 칼슘은 간극연접 (Gap-junction)에 의해 주위 세포로 전달 되는 것을 확인하였다. 이런 과정을 통해 1 um2 이하의 국소적인 광학적 자극에도 불구하고 근육조직 전체의 수축을 유도할 수 있음을 보였다.
세 번째 장에서는 펨토초 레이저에 의해 유발되는 세포독성에 관해 연구를 하였다. 펨토초 레이저에 의해 발생하는 일정 농도 이상의 활성산소종이 발생하면 자극을 받은 세포에서 세포독성이 일어난다. 레이저 자극은 특히 미토콘드리아 분열, 세포막 수포 형성 및 급격한 수축, 세포막 투과도 유지 특징을 갖는 세포죽음이 일어났다. 이는 세포괴사보다는 세포사멸과 비슷한 특징이지만 수 분내로 일어나는 매우 빠른 과정이다. 항산화제 (N-acetyl-cysteine)을 통하여 활성산소종이 세포독성에 관여하는 것을 확인하였고, 또한 미토콘드리아 동역학을 통하여 레이저 자극에 의한 세포죽음에 미토콘드리아가 관여한다는 점을 밝혔다. 레이저 자극에 의해 세포내 활성산소종이 형성되고, 미토콘드리아가 이를 조절할 수 없는 상태가 되면 세포죽음이 일어나게 된다. 펨토초 레이저에 의한 세포독성 연구는 안전한 의광학 기술로써의 기초연구일 뿐만 아니라 펨토초 레이저에 의해 유발된 활성산소종을 이용하여 활성산소종이 관여된 세포신호 연구 및 질병연구에 이용될 수 있다.
결론적으로, 본 연구에서 밝힌 펨토초 레이저에 의해 유발되는 세포 신호전달 및 그 응용은 향후 펨토초 레이저가 의광학 기술로 발전하기 위한 메커니즘 및 안정성, 응용에 중요하게 쓰일 것으로 기대된다.
