Molecular ecological approaches have detected diverse microorganisms that occur in response to pollution and bioremediation; however, most of these organisms have not been isolated, and their physiological traits are poorly understood. Phenol and chlorophenols are some of the major hazardous compounds in industrial wastewater, and for this reason biodegradation of phenol and chlorophenols has attracted keen attention. However, since most studies of phenol and chlorophenols biodegradation have been carried out under laboratory conditions with arbitrarily selected phenol and chlorophenols-degrading bacteria, the biodegradation in the environment is not well understood yet. The process of enrichment and subsequently isolation of aromatic compound-degrading bacteria has been applied using sewage sludge samples from sewage treatment plant in Gumi industrial complex. The enrichment method used in this study targeted bacteria degrading phenol, mono-chlorinated phenols. Pyrosequencing-based comparative genome analysis of phenol- and monochlorophenol-degrading bacteria diversity was used to compare the structure of bacterial communities at various steps of enrichment. For the easy and fast detection and isolation of bacterial populations capable of degrading aromatic compounds, Functional LmPH, C12O and C23O genes were used as molecular marker to confirm to assess the functional and genetic diversities of phenol- and chlorophenol-degrading bacteria. PCR primer sets were designed which can, respectively, amplify specific fragments from a wide variety of the multi-component phenol hydroxylase (LmPH), catechol l, 2-dioxygenase (C12O) and catechol 2, 3-dioxygenase (C23O) genes. To understand the bacterial diversity from the environment samples, we applied pyrosequencing to investigate bacterial community structure in sewage sludge samples and compared diversity of original sample and enrichment ones. The microbial community response may prove to be a much more comprehensive indicator of residual toxicity, which is more sensitive than single species toxicity screens, and can be used to complement the disappearance or sequestration of contaminants. Here, we demonstrated that pyrosequencing and a subsequent bioinformatic analysis provide an accurate, cost-effective and reliable way of obtaining qualitative and quantitative information on prokaryotic community structure in natural environments.
Functional LmPH, C12O and C23O genes were used to detect and screen the functional bacterial and also could used as molecular marker to confirm to assess the functional and genetic diversities of phenol- and chlorophenol-degrading bacteria in the environment. And bacterial and community structure, using high-throughput multiplex barcoded pyrosequencing, was accessed providing a great amount of community information of contaminated samples. The results elucidated that bacterial populations are extremely diverse in sludge samples that we expected, providing novel insights into the bacterial diversity in sludge samples and confirming that the barcoded pyrosequencing approach is a powerful tool for characterizing the microbial consortia in ecosystems.
염소화 페놀 분해 미생물을 전통적인 방법을 넘어 쉽고 빠르게 분리할 수 있는 분자생물학적 디텍션 및 분리 연구가 수행되었다. 독성물질을 분해하는 미생물에 관한 연구는 오래전부터 연구되어 왔지만 환경 전체에서 미생물에 의한 오염물질의 처리 및 다양성에 관한 연구는 많이 수행되어 있지 않다. 염소화 페놀은 독성물질로 생태계 파괴를 초래할 뿐만 아니라 암을 유발하여 공중 보건에도 악영향을 미치기 때문에 이들에 관한 철저한 연구와 관리가 필요하며 미국 EPA(Environmental Protection Agency)에 의해 priority pollutants로 지정되어 있다. 이러한 독성물질을 분해하는 세균의 디텍션 및 분리를 위해 구미 산업공단의 하수 처리장의 하수 슬러지 시료를 이용한 농화배양 및 분자생물학적 균주 분리법이 응용되었다. 농화배양법은 phenol, monochlorophenols 및 4-chlorobiphenyl을 분해하는 세균을 대상으로 하였다. 독성물질을 분해하는 기능을 지닌 미생물을 분리하기 위하여 phenol hydroxylase, chlorocatechol dioxygenases 및 biphenyl dioxygenase를 코딩하는 유전자를 분자생물학적 마커로 사용하였으며 이러한 유전자를 증폭하는 프라이머를(Lph, C12O, C23O) 이용하여 colony PCR 방법으로 분리된 미생물의 독성물질 분해 기능을 확인하고 HPLC를 이용하여 분해 기능을 확인하였다. 분리된 균주들은 16S rRNA 유전자 염기서열에 기초한 계통학적 연구가 수행되었다. 환경 샘플 내의 전체 미생물의 consortia를 확인하고 미생물 종간의 상호작용을 분석하기 위하여 오리지널 샘플과 페놀 및 염소화 페놀을 사용하여 농화된 샘플에서 DNA를 추출하여 파이로시쿼싱을 진행하였다.
분리된 균주 147개 중 38.8%가 γ-Proteobacteria에 23.1%가 α-Proteobacteria, 21.8%가 Actinobacteria, 5.4%가 β-Proteobacteria, 3.4%가 Firmicutes, 2.7%가 Bacteroidetes, 1.4%가 Verrucomicrobia, 0.7%가 Acidobacteria에 속하였으며 나머지 2.7%는 uncultured bacterium에 속하여있는 것을 보여 주었다. 분리된 147개 균주 중 60개 균주가 colony PCR 증폭에서 관련된 유전자가 증폭되었고 그 중 40개 균주는 독성물질 분해 능력을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 본 연구에서 사용된 프라이머는 순수 배양뿐만 아니라 환경 샘플 내의 독성물질 분해기능을 가진 미생물의 다양성 분석에 분자생물학적 프로브로 사용될 수 있을 것으로 사료된다. 하수 슬러지 오리지널 샘플 내 33.78% (3,842 sequences)가 Proteobacteria, 21.99% (2,501 sequences)가 unclassified bacteria, 15.37% (1,784 sequences)가 Bacteroidetes, 12.09% (861 sequences)가 Firmicutes에 소속되어 있었다. Proteobacteria 중 Alphaproteobacteria가 35.79% (1,375 sequences)로 가장 도미넌트하게 분포되어 있었고 다음으로 Gammaproteobacteria가 18.14% (697 sequences), Deltaproteobacteria가 16.92% (650 sequences), Betaproteobacteria가 16.81% (646 sequences) 였다.
본 연구는 분자생물학적 방법으로 염소화 페놀을 분해하는 미생물을 디텍션하고 분리하였으며 barcoded pyrosequencing을 통한 오염된 하수 슬러지와 농화된 샘플의 미생물 컨소시엄을 밝혀냄으로 현재 까지 밝혀 지지 않았던 환경 내의 미생물의 전반적인 커뮤니티가 밝혀져 금후 오염된 환경의 생물학복원에 새로운 방향과 참신한 정보가 될 것으로 사료된다.
