Complex traits are determined by multiple genetic and environmental factors. Here, I indentify genetic variants associated with a complex disease, systemic lupus erythematosus (SLE), and with response to an immunosuppressant drug, cyclophosphamide, by genome-wide and candidate association study using large-scale control-case cohorts.
PART I: SLE is a chronic autoimmune disease with etiology that includes high genetic contribution relative to environmental factors. Using candidate gene association study, I identify the genetic and possible functional association of polymorphisms in the ICAM1-ICAM4-ICAM5 (intercellular adhesion molecule 1, 4, and 5) locus, IFNG (interferon-gamma), and CDKN1A (Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A; p21; Cip1) with susceptibility to SLE.
Several common variants in the ICAM1-ICAM4-ICAM5 locus on chromosome 19p13 are associated with increased susceptibility to SLE in a large-scale case-control study using 17,481 unrelated participants from 4 ancestry populations. Specifically, the minor A allele in rs3093030, previously associated with increased plasma levels of soluble ICAM1, shows the strongest association with increased SLE susceptibility (P = 4.88 ?? 10??10; OR = 1.16, 95% CI 1.11??1.22) not only in the trans-ancestry meta-analysis but also in all individual ancestry populations. This finding supports the contribution of an ICAM-mediated pathway to SLE susceptibility.
For the IFNG locus, SLE susceptibility association was significant with rs2069705 in the promoter (adjusted OR = 2.27, P = 0.0024) and marginal with rs3181032 in the promoter (P = 0.037), rs2430561 on an NF-??B binding site in the first intron (P = 0.022) and rs2069718 in the third intron (P = 0.026) in a recessive genetic model for a discovery population of 742 Korean SLE patients and 1,017 unaffected controls. Furthermore, the replication study on the regulatory SNP rs2430561 reveals that the SNP was marginally associated with SLE in an validation population of 856 SLE patients and 1,523 unrelated controls and significantly associated in the discovery and validation population (adjusted OR = 2.38, P = 0.0010), supporting previous association of IFNG expression with SLE susceptibility.
For the CDKN1A locus, I examined four SNPs within the promoter and two SNPs in the first intron of CDKN1A for association with SLE susceptibility. A comparison of 742 Korean SLE patients with 1,017 controls disclosed that one SNP (rs762624 C>A at position ??899), located at a putative Myb-binding site in the promoter, was associated with SLE susceptibility (P = 0.00047). This association was independent of the SLE-association signal of HLA-DRB1 on 6p21.3, as it was significant after adjustment for SLE-risk DRB1 alleles (P = 0.0012). The same SNP was associated with lupus nephritis (P = 0.000014). The risk allele-carrying promoter sequence displayed approximately 15% lower activity than the non-risk sequence upon fusion to the luciferase gene (P = 0.025). Endogenous CDKN1A mRNA levels measured in Epstein-Barr virus-transformed B cells established from 16 control subjects were linearly correlated with a decreasing copy number of the risk allele (P = 0.024). Therefore, the minor allele A at ??899 of CDKN1A is associated with increased susceptibility to SLE and lupus nephritis, and decreased cellular levels of p21.
Additionally genome-wide association study (GWAS) followed by validations using extended subjects reveals a novel SLE-associated locus downstream of PTTG1 3’ (P = 7.26 x 10-7; OR = 0.75 at rs2431697) in 1,598 Korean SLE patients and 2,540 controls. When the effect size was combined with the reported effect size from the European female SLE cohort where the SLE association of rs2431697 was suggestive, rs2431697 showed much stronger association signal (P = 1.62 ?? 10-15; OR = 0.80).
These results would help to understand the pathogenesis and mechanism of SLE and the discovered genes and SNPs could be effective targets for drug development and genetic markers in effective prediction and diagnosis kits for SLE onset.
PART II: Kidney is one of the most vulnerable organs in SLE. Lupus nephritis affects about 43% of the SLE patients in Korea, 55% in Asian, 51% in African lineage, 43% in Hispanic population, and 14% in Caucasians, which results in renal failure and death of the affected.
For several decades, drugs and their combinations against lupus nephritis have been developed. Among the drugs, cyclophosphamide has been frequently used and improved the renal outcomes of lupus nephritis patients. However, the efficacy to cyclophosphamide varied widely from individual to individual.
I examined about 580,000 SNPs in the human genome to identify genetic variations associated with response to the drug using lupus nephritis subjects treated with it. The association was significant with a SNP rs6697139 in the Fc-gamma receptor gene cluster (P = 3.42 ?? 10-8) and suggestive with 338 other suggestive SNPs associated with the response by GWAS using lupus nephritis cohorts treated with cyclophosphamide. The SNP rs6697139 is located in an intergenic region between FCGR2B and FCRLA and the minor allele A of rs6697139 was only found in the no response group (5 out of 16; 31.3%) but not the response group (0 out of 93; 0.0%).
These findings provide useful genetic markers in the coming age of personalized medicine as well as new insights to connect the response-associated genes to the metabolic pathway of cyclophosphamide.
한 개체에 나타날 수 있는 다양하고 복잡한 특징은 많은 수의 유전 인자와 환경인자에 의해 결정된다. 본 학위 논문의 저자는 자가면역질환인 루푸스의 발병 및 면역억제제 싸이톡산의 반응성과 연관된 유전 인자 다수를 규명하였다. 본 연구를 위해 약 17,500명의 루푸스 환자군과 대조군의 유전체 샘플이 사용되었고, 후보 유전자 연관 연구법(candidate-gene association study)과 유전체 전체 연관 연구법(genome-wide association study)이 수행 되었다.
<루푸스 연관 유전 변이 규명>
1. 루푸스 발병은 다른 질환에 비해 유전 인자의 영향력이 큰 질환 중 하나이다. 루푸스 자가항체의 생성은 환자의 신체 곳곳에 만성적인 염증 반응을 유발하고 환자의 생명과 건강을 위협한다. 본 저자는 후보 유전자 연구법을 통해 루푸스 환자군과 대조군의 유전체 서열을 비교/분석하여 (1) ICAM1-ICAM4-ICAM5 유전자, (2) IFNG 유전자, (3) CDKN1A 유전자가 루푸스 연관 유전자임을 규명하였다.
(1) 염색체 19p13내 존재하는 ICAM1-ICAM4-ICAM5 유전자 부위에 위치한 다수의 유전변이가 루푸스 감수성과 연관성이 있음을 17,481명으로 구성된 4개 인종의 유전변이 분석을 통해 규명하였다. 특히 혈장 내 soluble ICAM1의 농도와 관련된 유전변이가 모든 인종에서 연관성을 보였고, 가장 강한 연관성이 존재하였다 (P = 4.88 ?? 10??10; OR = 1.16, 95% CI 1.11??1.22). 이 결과는 루푸스 감수성이 ICAM-mediated pathway에 의해 영향을 받음을 강하게 제시한다.
(2) IFNG는 루푸스 환자와 동물모델에서 높은 발현양을 보이는 cytokine중 하나이다. 고밀도의 유전변이 분석을 통해 IFNG내 다수의 유전변이가 루푸스와 연관되어 있고, NF-??B 결합 부위에 위치한 유전변이의 루푸스-위험 변이가 존재할 경우 해당 유전자의 발현양이 증가함을 규명하였다. 발현 조절 변이는 약 4,100여명의 한국인에서 규명 및 재 검증이 되었다 (adjusted OR = 2.38, P = 0.0010).
(3) 염색체 6p21.2에 위치한 CDKN1A 유전자의 promoter내 유전변이가 루푸스 및 신장염과 연관성이 있음을 규명하였다 (P = 0.00047, P = 0.000014). CDKN1A의 연관성은 1,700여명의 DNA 분석을 통해 발견하였고, 6p21.3에 위치한 HLA의 루푸스 연관성과는 독립적임을 발견하였다. 해당 유전변이는 Myb 결합 부위에 위치해 있으며 루푸스-위험 변이가 존재할 경우 CDKN1A의 발현양이 감소됨을 in vitro, in vivo 수준에서 검증하였다.
2. 유전체 전체 연관 연구와 심층 후속 연구를 통해 새로운 루푸스 유전자인 PTTG1 유전자를 규명하였다 (P = 7.26 x 10-7; OR = 0.75 at rs2431697). 약 900여명의 환자군-대조군 코호트에 대해 약 580,000개의 유전변이를 분석함으로 다수의 후보 유전변이를 발굴하였고 추가로 분석된 약 3,200명의 결과로부터 해당 연관성이 검증되었다. 또한 백인종의 루푸스 연관 분석과 메타 분석을 하였을 경우, 더욱 강한 연관성을 발견할 수 있었다 (P = 1.62 ?? 10-15; OR = 0.80).
본 연구의 결과는 루푸스 발병 기작을 이해하는데 도움을 줄 수 있고 신약개발 시 약물의 표적물로 이용 될 수 있다. 또한 발병 예측/진단 키트 개발 시 유용한 유전자 표지자로 활용 될 수 있다.
<싸이톡산 반응성 연관 변이 규명>
신장(kidney)은 루푸스 발병 시 가장 손상 받기 쉬운 기관 중 하나이다. 루푸스 신장염은 한국인에서 43%, 다른 아시아인에서 55%, 흑인에게서 51% 라틴계에서 43%, 백인에서 약 14%의 루푸스 환자에게서 발생된다.
루푸스 신장염의 치료를 위해서 지금까지 여러 약물이 개발 되었는데 그 중 하나는 싸이톡산으로, 임상 투여 시 증상완화 효과가 있어 현재 빈번하게 사용되고 있다. 하지만 해당 약물을 투여받은 사람의 약효는 개인간 큰 차이를 보인다.
본 저자는 싸이톡산 치료를 처방 받고 그 반응성 유무가 추적된 109명의 유전체를 약 580,000개의 유전변이를 분석함으로 반응성과 연관된 유전변이를 규명하고자 하였다. 그 결과, 약물반응성 결정에 유전 인자가 영향을 준다는 것을 발견하였고, 특히 Fc-gammam receptor gene cluster 부위 내 rs6697139 유전변이가 강력한 연관성을 보임을 규명하였다 (P = 3.42 ?? 10-8). 해당 유전변이의 저빈도 변이는 약물 무반응 그룹에서 31.3% (16명 중 5명) 발견되었으나 약물 반응 그룹에서는 전혀 발견되지 않았다 (90명 중 0명).
본 연구로 규명/제시된 유전변이는 개인맞춤치료에 활용 될 수 있는 유용한 유전자 표지자로 활용될 수 있고 약물 대사 이해에 도움을 줄 것이다.
