Vessel formation is one of the crucial step during development and tumor growth due to the need of nutrition, oxygen supply and clearance of the waste product from every single cell in the tissue. Angiogenesis is a new vessel outgrowth from pre-existing vasculatures, and the most initial step of this is tip and stalk cell specification. Tip cells are highly mobile, non-proliferative cells located in the leading edge of the sprouting vessel. Tip cell then induces stalk cells characterized by non-motile, proliferative, tubulogenic cells. So far, Notch receptor signaling, activated by Dll4 in tip cells, is the key regulator for inducing stalk cells. However, the molecule that is responsible for these active properties of tip cell and how Dll4/Notch signaling inhibits this molecule in stalk cell is still not clear. And also, there have been only few studies about transcription factor regulating tip/stalk formation. Here, we show the role of transcription factor Sox17 in tip/stalk cell specification and sprouting angiogenesis.
In the developmental vessel, Sox17 was highly expressed in most of the endothelial cell and not in the mural cell. Loss of Sox17(Sox17 LOF) in endothelial cell using Tie2-cre;Sox17gfp/fl embryo resulted in vascular remodeling defect and subsequent arrest in the primitive capillary plexus stage. Gain of endothelial Sox17(Sox17 GOF) using VE-cadherin tTA;TetO-Sox17 mice resulted in increased vascular density, sprouting, filopodial extrusion throughout the developmental period. This excessive vascular remodelling in Sox17 GOF mutant also resulted in disruption of vascular integrity, loss of endothelial cell polarity, lack of vascular lumen formation and missing of circulating hematopoietic cells.
In the adult stage, Sox17 expression was restricted to arteries in quiescent vessels. However in angiogenic condition like tumor, Sox17 was re-elevated in endothelial cells. Sox17 LOF model LLC tumor showed reduced vascular density and reduced filopodial protrusion. Sox17 GOF model with B16F10 melanoma showed exactly opposite phenotype, that is, increased vascular density and filopodia formation.
In postnatal retinal vessels which well represent sprouting angiogenesis, Sox17 was highly expressed in tip cells compared to stalk cells. Sox17 deletion with a inducible VE-cadherin-CreERT2;Sox17gfp/fl model showed decreased radial growth, reduced filopodia and tip cell. Sox17 GOF increased filopodia and tip cell conversely.
Sox17 knock-down in HUVEC down-regulated tip cell enriched genes. Also the cell junction was stabilized and the migration was reduced. This cellular phenotype was also shown in ESC-derived endothelial cell(EC) model. Sox17 knock-out EC showed less filopodia and lamellipodia, tightened cell junction and re-arrangement of actin fiber to subcortical location indicating quiescent state.
Sox17 expression and Notch activity showed inverse correlation in tip and stalk cells. VE-cadherin-CreERT2; N1ICD mouse and N1ICD plasmid vector transfection was used for in vivo and in vitro study respectively. Notch over-expression showed marked down regulation of Sox17. On the other hand, notch inhibition by DAPT increased Sox17 level in-vitro and in-vivo as well. Notch inhibition in retinal angiogenesis clearly increases branching and filopodial protrusion. However, in Sox17 deficient state this increment was not shown indicating Sox17 is a down-stream effector of Notch signaling in tip/stalk cell formation.
Transcription factor Sox17 reveals to be a pro-angiogenic molecule specifying tip and stalk cell characteristics under the regulation of notch signaling.
혈관형성은 발생 단계에서나 종양 성장 단계에서 매우 중요하다. 혈관 신생이란 기존에 존재하던 혈관에서 새롭게 혈관이 뻗어 나오는 것이다. 혈관 신생의 첫 과정은 Tip Cell(TC)과 Stalk Cell(SC)이 분화되는 것이다. TC는 뻗어 나오는 혈관의 가장 말단부에 존재하며 분열하지 않고 활동성이 높다. TC가 분화되고 나서 이 TC의 신호에 의해 운동성이 없고 증식을 하며 내경을 형성하는 특성을 갖는 SC가 분화된다. 그러나 이러한 과정에 어떤 하위 분자나 기전을 통해 TC 특이 기능을 갖게 되고 Dll4/Notch 신호가 어떻게 이러한 분자를 조절하여 SC의 특성을 갖게 되는지 알려지지 않았다. 또한 현재까지 밝혀진 바에 따르면 TC와 SC를 조절하는 분자들은 성장인자/수용체 기전을 갖는 것이 대부분이었고 전사인자에 의한 조절에 대해서는 거의 알려지지 않았다.
저자는 전사인자 Sox17이 TC와 SC 분화, 나아가서는 혈관 신생에 어떤 영향을 주는지 조사하였다. 태아 발생 혈관에서 Sox17은 혈관 내피세포에 특이적으로 발현하였고 주변세포에서는 발현되지 않았다. Tie2-cre; Sox17gfp/fl 생쥐 모델을 사용하여 혈관 내피세포 특이적으로 Sox17을 결손시키면 혈관 리모델링에 문제가 발생하였고 결과적으로 원시 혈관총 형태에서 멈춰 있었다. VE-cadherin tTA; TetO-Sox17 생쥐 내피세포에서 Sox17 과발현은 반대로 혈관 밀도, 발아, 사상 위족의 형성을 증가시켰다. 결과적으로 Sox17의 과발현은 혈관 안정성과 극성을 파괴시키고 혈관 내경과 혈관내 혈액 세포의 결핍을 일으켰다.
안정 상태 성체에서 Sox17은 동맥에서만 발현되고 정맥이나 모세혈관에서는 발현되지 않았다. 그러나 종양과 같이 혈관 신생을 촉진하는 상태에서는 모든 혈관에서 재발현되었다. LLC(Lewis lung carcinoma) 종양을 사용한 Sox17 결손 모델에서는 종양 혈관 밀도와 사상 위족의 형성이 감소되었다. 반대로 B16F10 흑색종을 사용한 Sox17 과발현 모델에서는 혈관 밀도와 사상 위족의 형성이 증가되었다.
생쥐 출생 직후 망막혈관을 보면 Sox17은 SC보다 TC에서 특이적으로 발현하였다. VE-cadherin-CreERT2; Sox17gfp/fl 생쥐모델에서 Sox17을 결손시키면 혈관 길이, 사상 위족, TC 형성이 감소되었다. Sox17을 과발현시키면 반대의 현상이 확인되었다.
세포학적 관점에서 Sox17의 역할을 보기 위하여HUVEC모델에서 Sox17을 결손시키면 TC 특이 유전자들이 감소되었으며, 세포막-세포막 연결선이 강화되고 세포 운동성은 감소하였다. 이러한 모습은 배아 줄기 세포 유래 혈관 내피세포에서도 확인되었다. 사상 위족과 접착용 세포족 감소, 세포막 연결선 강화, 액틴 섬유의 세포막하 재배열을 보였고 이는 안정된 세포상태를 반영하였다. Sox17 발현과 Notch 활동은 TC과 SC에서 상반된 관계를 보였다.
VE-cadherin-CreERT2; N1ICD 생쥐 모델과 N1ICD 벡터 세포도입법을 사용하여 Notch 기능을 강화시키면 Sox17 발현이 감소되었다. 반대로 DAPT를 사용하여 Notch 활동을 약화시키면 Sox17 발현이 증가되었다. 망막 혈관 모델에서 Notch 기능을 차단하면 혈관 분기와 사상 위족이 증가된다. 그러나 Sox17이 결손된 생쥐에서 똑같이 Notch의 기능을 차단할 경우 이러한 변화가 관찰되지 않았다. 따라서 Sox17은 TC와 SC 형성 및 혈관신생 과정에서 Notch의 기능을 수행하는 중요한 하위분자임을 알 수 있었다.
이상의 실험 결과로 보아 전사인자 Sox17은 혈관신생 촉진인자이고 혈관신생 과정에서 Notch의 영향하에 TC와 SC 형성을 관장함을 알 수 있다.
