Engineering surface properties of scaffold materials is a critical step for tissue engineering because such properties significantly influence cellular behaviors, such as adhesion, proliferation, migration, and differentiation. Among many parameters that affect cell-material interactions, surface chemistry and topography are major factors to be considered in the design of scaffold materials that mimic chemical and physical features of microenvironments in native tissues. In this thesis, mussel-inspired polydopamine functionalization of scaffold materials was studied for the investigation of adhesion, proliferation, and differentiation of mammalian cells such as osteoblasts, endothelial cells, and myoblasts. The effect of scaffold topography on cell-material interactions was also examined in combination with surface chemistry of substrates. Moreover, the applicability of carbon nanomaterials (e.g., graphene oxide, reduced graphene oxide) to tissue engineering is discussed.
Chapter 1 and 2 describe a versatile route for promoting cell adhesion and viability on various non-wetting surfaces, inspired by mussel adhesion mechanism. The oxidative polymerization of dopamine, a small designer molecule of the DOPA-K motif found in mussels, results in the formation of polydopamine ad-layer on any material surface. Chapter 1 shows that polydopamine coating can enhance cell adhesion on any type of material surfaces including anti-adhesive substrates. Mammalian cells well adhere and undergo general cell adhesion processes (i.e., attachment to substrate, spreading, and cytoskeleton development) on polydopamine-modified surfaces, while they barely adhere and spread on unmodified non-wetting surfaces. In Chapter 2, the spatial control and patterning of mammalian cells are achieved by combining the non-adhesive property of hydrophobic substrates and the adhesive property of polydopamine. The cells align in the direction of striped polydopamine patterns, and this tendency is not limited by the type of cell line.
In Chapter 3, the applicability of polydopamine-based surface modification to vascular tissue engineering is investigated. The endothelialization of prosthetic scaffold is believed as a promising strategy to improve the effectiveness of small-diameter vascular grafts; thus, a nanofibrous scaffold that has a polymeric core and a shell mimicking mussel adhesive is developed by electrospinning technology, followed by surface modification. On polydopamine-modified polymer nanofibers, endothelial cells exhibit the highly enhanced adhesion and viability, the increased stress fiber formation, and the positive expression of endothelial cell markers (e.g., PECAM-1 and vWF), when compared with unmodified and gelatin-modified nanofibers. These findings indicate that the creation of a mussel-inspired polydopamine ad-layer on electrospun nanofibers is a promising and effective strategy for vascular tissue engineering that requires efficient endothelialization of graft surfaces.
Chapter 4 describes the effects of polydopamine coating combined with topographical cues on behaviors of skeletal myoblasts. When myoblasts are grown on planar glass substrates, the polydopamine ad-layer well supports the adhesion and proliferation of myoblasts and enhances the differentiation of myoblasts into multinucleate myotubes. To resemble the highly ordered architectures of skeletal muscle tissue, the well-aligned polymeric nanofibers are fabricated, and then decorated with polydopamine layers. On polydopamine-modified nanofibers, myogenic protein expression and the fusion of myoblasts increased significantly compared with those on unmodified nanofibers. The multinucleate myotubes on the aligned nanofibers are oriented in a direction parallel to the nanofibers. These results suggest that combination of mussel-inspired polydopamine functionalization with uniaxial topography is useful for skeletal tissue engineering.
Chapter 5 deals with the synergic effects of nanofiber alignment and electroactivity on myoblast differentiation. The nanofibrous substrates that possess both topographical cues and electroactivity are developed through the electrospinning of biodegradable polymer/conducting polymer blends. It is found that neither nanofiber alignment nor the concentration of the conducting polymer influences cell growth and proliferation, but cell morphology is highly dependent on the fiber alignment. Moreover, the differentiation of myoblasts on nanofibers, which is analyzed by myogenic protein expression, multinucleate myotube formation, and expression of differentiation-specific genes, is strongly dependent on both nanofiber alignment and the concentration of the conducting polymer. These results suggest that topographical cues and the electroactivity of nanofibers synergistically stimulate muscle cell differentiation to make polymeric nanofibers a suitable scaffold material for skeletal tissue engineering.
Chapter 6 reviews recent research advances in the application of carbon-based nanomaterials (e.g., graphene sheets and carbon nanotubes) as a potential candidate for the development of artificial scaffolds. Carbon nanomaterials possess unique mechanical, electrical, and optical properties that present new opportunities for tissue engineering. They can also provide a similar microenvironment as like a biological extracellular matrix in terms of chemical composition and physical structure. This Chapter summarizes the effects of carbon nanomaterial-based substrates on cellular behaviors, including cell adhesion, proliferation, and differentiation into osteo- or neural lineages. The development of 3D scaffolds based on carbon nanomaterials (or their composites with polymers and inorganic components) is introduced, and the potential of these constructs in tissue engineering, including toxicity issues, is discussed.
Lastly, Chapter 7 presents the myotube formation on graphene-based nanomaterials, particularly graphene oxide (GO) and reduced graphene oxide (rGO). The behaviors, including adhesion, proliferation, and differentiation, of myoblasts on unmodified, GO-, and rGO-modified glass substrates are studied. The myogenic differentiation, analyzed by myogenic protein expression, multinucleate myotube formation, and expression of differentiation-specific genes, is remarkably enhanced on GO, which results from serum protein adsorption and nanotopographical cues. These results demonstrate the ability of GO to stimulate myogenic differentiation, showing a potential for skeletal tissue engineering.
조직공학은 생체조직의 구조와 기능의 상관관계를 이해하고 사고나 질병으로 인해 손상된 조직의 기능을 유지, 향상, 또는 복원하기 위한 생체 조직의 대체 재료를 개발하고자 하는 응용 학문이다. 인체 내 이식 가능한 생체재료, 즉 인공 스캐폴드의 개발에 있어서는 세포의 부착, 증식 및 분화가 잘 이루어질 수 있도록 세포-물질간 상호작용을 조절하는 것이 중요하다. 이를 위해서는 소재의 표면 특성을 조절하는 방법을 사용할 수 있는데, 생체 내 환경과 유사한 특성을 가지도록 생체조직의 화학적 특성 혹은 물리적/구조적 특성을 모방함으로써 세포-물질간 상호작용을 향상시킬 수 있다. 본 논문에서는 홍합 접착 단백질의 우수한 화학적 특성을 모방한 폴리도파민 (polydopamine)을 이용하여 인공 스캐폴드의 표면을 개질하고, 이에 대한 세포의 부착력, 성장, 분화 등을 살펴보았다. 또한 세포외기질 (extracellular matrix)의 구조적 특성을 모방한 전기방사 나노섬유를 제조하고 그 정렬의 차이에 따른 세포의 행동을 관찰하였다. 마지막으로 탄소 나노소재의 조직공학적 응용 가능성에 대한 연구를 진행하였다.
제 1장 및 2장에서는 홍합의 접착 메커니즘에서 유래한 폴리도파민을 이용하여 고분자 기판을 표면개질하고, 이에 대한 세포의 부착력을 관찰하였다. 일반적으로 인공 스캐폴드의 소재로 사용되는 고분자는 그 성질이 소수성인 경우가 많기 때문에 본 연구에서는 폴리에틸렌, 폴리테트라플루오르에틸렌, 실리콘 고무, 폴리디메틸실록산 등의 고분자를 사용하였으며, 표면개질 후 부착의존적 세포인 골아세포 (preosteoblast, MC3T3-E1)의 부착 정도를 확인하였다. 표면개질 전에는 세포 부착이 제대로 일어나지 않아 세포가 작고 둥글거나, 얇고 긴 형태를 보이는 반면, 표면개질 후에는 골세포의 정상적인 fibroblastic 형태를 보였다. 이러한 성질을 이용하여 세포의 부착이 용이하지 않은 소수성 고분자 기질의 일부분만을 폴리도파민으로 표면개질하면, 폴리도파민 층이 형성된 부분에만 세포가 선택적으로 부착된 후 성장하기 때문에 세포 패터닝 시스템을 개발할 수 있다. 결론적으로 폴리도파민을 이용하여 인공 스캐폴드의 표면을 개질할 경우 세포 부착력이 뚜렷이 증가함을 알 수 있다. 이러한 세포 부착의 증가는 폴리도파민이 세포의 부착을 돕는 혈청 단백질의 기질 표면 바인딩에 영향을 주기 때문으로 보인다. 일반적인 고분자 재료의 경우 단백질이 표면에 흡착될 때 표면의 소수성으로 인해 구조 변화가 일어나 세포 부착을 지원할 수 없는 반면, 폴리도파민으로 표면개질할 경우 단백질이 본래의 구조대로 바인딩 하기 때문에 세포 부착이 잘 이루어 질 수 있다.
제 3장에서는 폴리도파민으로 표면개질된 나노섬유 인공 스캐폴드 상 혈관내피세포의 부착 및 성장에 관한 연구를 다루었다. 세포외기질의 섬유 구조를 모방하기 위해 전기방사 시스템을 이용하여 나노섬유를 제조하고, 이를 폴리도파민으로 코팅하였다. 이렇게 표면개질된 고분자 나노섬유는 혈관내피세포 (HUVEC)의 부착력을 증가시켰으며, 스캐폴드 상 세포의 퍼짐 역시 증가하였다. 또한 폴리도파민으로 표면개질된 나노섬유가 표면개질 전 혹은 젤라틴으로 코팅된 나노섬유에 비해 세포를 더 잘 생존시키는 것으로 나타났다. 폴리도파민 층 위에서 생존한 혈관내피세포의 기능을 확인하기 위해 혈관내피세포의 마커인 PECAM-1 및 vWF 단백질 등을 면역 염색하여 그 발현 정도를 살펴본 결과, 폴리도파민으로 표면개질된 나노섬유에서 그 발현이 현저히 증가하였다. 이러한 결과들로부터 폴리도파민 코팅은 혈관내피세포의 부착, 생존, 마커 단백질 발현 등을 증가시킨다는 결론을 얻을 수 있었다.
제 4장에서는 폴리도파민을 이용한 표면개질이 세포의 분화에 미치는 영향에 관한 연구를 수행하였다. 근아세포 (myoblast, C2C12)를 분화 조건 하에서 배양한 후 분화 마커인 myosin heavy chain (MHC)을 면역 염색하면, 폴리도파민으로 표면개질 된 기판에서 MHC-양성 면적이 증가하였다. 또한 다핵성 근관세포의 형성이 증가하여 fusion index, maturation index 등이 상승하였다. 근육 조직의 정렬된 구조를 모방하기 위해, 이방성 정렬을 가지는 나노섬유를 제조하고 폴리도파민으로 표면개질하면, MHC 단백질 발현, 다핵성 근관세포의 형성 등이 증가하였으며, 근관세포는 나노섬유의 방향을 따라 잘 정렬된 형태를 나타내었다. 결론적으로, 홍합 유래 표면 개질법과 나노섬유의 정렬을 결합한 인공 스캐폴드는 근조직공학에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 보인다.
제 5장에서는 근육조직의 구조적 특성 및 전기활성 특성을 모방하여 이방성 정렬을 가지는 전도성 나노섬유를 제조하고, 나노섬유의 정렬 및 전도도가 근조직 재생에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, 첨가한 전도성 고분자 폴리아닐린의 농도가 증가하고, 나노섬유가 잘 정렬되어 있을수록 근아세포의 분화 마커인 MHC 단백질의 발현이 증가하였다. 다핵성 근관세포의 형성 및 분화 유전자 (myogenin, troponin T, MHC)의 발현 역시 폴리아닐린 농도, 나노섬유의 정렬과 비례하여 증가하였다. 일련의 결과들을 통해 나노섬유의 정렬 및 전도성 고분자의 첨가는 근아세포의 분화를 향상시킨다는 결론을 얻을 수 있었다.
제 6장에서는 그래핀 (graphene), 탄소 나노튜브 (carbon nanotube) 등 탄소 나노소재가 세포의 부착, 성장, 분화 등에 미치는 영향과 탄소 나노소재를 이용한 3차원 스캐폴드의 제조, 이러한 구조의 조직공학적 응용가능성에 관한 문헌을 조사하였다. 이러한 문헌조사 내용을 기반으로 제 7장에서는 산화 그래핀 (graphene oxide, GO)와 환원된 산화 그래핀 (reduced graphene oxide, rGO)이 세포의 부착, 증식, 분화에 미치는 영향을 다루었다. 그 결과에 따르면GO 및 rGO 모두 세포의 부착 및 증식을 잘 유지하는 반면, 근아세포의 분화는 GO 위에서 현저하게 증가하였다. 세포 분화에 관한 연구는 MHC 단백질 발현, 다핵성 근관세포의 형성 및 분화 유전자 (myoD, myogenin, troponin T, MHC)의 발현 등의 분석을 통해 이루어졌다. GO 위에서의 세포 분화 상승 효과는 그래핀 소재의 nanotopography와 표면 산소 성분에 의한 혈청 단백질 흡착에 의한 것으로 보인다.
결론적으로, 본 학위논문에서는 홍합의 접착력, 세포외 기질의 구조적 특성, 근육 조직의 정렬성과 같은 생체 시스템의 특성을 모방하여 나노소재의 표면 특성을 조절하고 이들의 조직공학적 응용가능성에 대해 연구하였다. 이러한 생체모방적 접근법은 조직공학을 위한 인공 스캐폴드 소재를 설계하고 개발하는데 기여할 것으로 기대된다.
