Polymerase chain reaction (PCR) has been considered as a gold standard method of nucleic acids analysis in the fields of clinical diagnostics, microbiological detection, forensics, environmental screening, and food safety testing. Recently, many efforts have been dedicated to transforming the conventional PCR platform into lab-on-a-chip based miniaturized system due to the advantages of high-speed analysis, high-throughput capability, low reagent consumption, and portability. In this thesis, I have focused on the devel-opment of an integrated genetic analysis microdevice for on-site multiplex single nucleotide polymorphism (SNP) typing. For application to on-site genetic analysis using PCR, the process for separation and detection of resultant PCR products should be integrated with the PCR function on a single chip format. In addition, the fluorescence-based optical instrumentation and a peripheral device for detection and operation of the microsystem need to be miniaturized to realize the portable genetic analysis system.
In Chapter 3, an allele-specific polymerase chain reaction (AS PCR) and capillary electrophoresis (CE) were integrated into a 4-in single chip platform, which was then applied for on-site identification of HANWOO (Korean indigenous beef cattle). The glass-based microchip consists of four layers: a microchan-nel plate for microfluidic control, a Pt-electrode plate for a resistance temperature detector (RTD), a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) membrane and a manifold glass for microvalve function. The AS PCR for multiplex SNP typing was conducted on a 2-μL PCR reactor. After AS PCR, the amplicons were moved to the CE injection channel by electrophoretic force, and then separated along the CE separation channel through the sieving matrix. At the end of the separation channel, the miniaturized fluorescence detector could gain the fluorescence signal from the amplicons, showing the electropherogram of the AS products. The operations of sample loading, AS PCR, microvalve, and CE on a chip were automated with a portable genetic analyzer, and the laser-induced fluorescence detection was performed on a miniaturized fluorescence detector. Based on the chip structure and operation, the single nucleotide polymorphisms (SNPs) were analyzed. Eleven sets of primers were designed for targeting beef cattle’s SNP loci for HANWOO identification and one primer set for a positive PCR control. With the allele-frequency analysis of each SNP, the criteria number of the AS PCR amplicon for HANWOO typing was evaluated. If the number of AS PCR product is four or under, 100% samples (601 heads) are proven to be HANWOO. Using the integrated AS PCR-CE microcevice with portable instrumentation, the blind samples were correctly identified as a HANWOO by showing one or two amplicon peaks in the electropherogram, while the imported beef cattle revealed more than five peaks. As a result, the integrated AS PCR-CE microsystem provided the successful multiplex SNP typing portable platform with high speed (less than 80 min) and multiplexity (12-plex including a positive control).
In Chapter 4, the AS PCR function was integrated with the microarray format. The integrated AS PCR-microarray chip mainly consisted of two parts: the AS PCR-micromixer chip and a disposable microar-ray chip. The AS PCR-micromixer chip has a micropump, a PCR reactor, and a micromixer channel on a 4-inch borofloat glass wafer. A four-point RTD was located near the PCR chamber by thermal bonding with an RTD-patterned glass wafer. In addition, glass manifold and PDMS membrane were positioned on the mi-crovalve and micropump for pneumatic control. The disposable microarray chip comprised the array patterned slide glass, and the thin and sticky PDMS wall, which could be easily attached under the end of micromixer channel of the AS PCR-micromixer chip. In a same way with the PCR-CE microdevice, the AS PCR was performed in the 2-μL PCR chamber followed by mixing with the injected hybridization buffer in a micromixer channel, and then the mixed sample was placed in a microarray chip for the downstream analysis. In addition, for rapid time-to-result of the hybridization on a microarray chip, the micropump-induced convection flow was used by controlling the flow direction which could be activated by changing the open order of three valve components of the microcpump. All the operations were automated with a portable genetic analyzer and a portable fluorescence scanner using laptop software. Based on the AS PCR-microarray chip, eleven-plex SNP typing for HANWOO identification was carried out. As expected, the HANWOO showed only one or three signals, while the imported beef cattle showed more than five ones. In addition, the incubation time for microarray could be decreased from 60 min down to 30 min by micropump-induced convection flow. As a result, the AS PCR-microarray chip could also supply the multiplex SNP genotyping portable platform with a convenient disposable microarray chip. Based on these two genetic analysis microsystem (AS PCR-CE and AS PCR-microarray), multiplex SNP typing could be conducted with high speed and accuracy on a portable instrumentation. These advanced microsystems can be utilized for a variety of biomedical research fields including point-of-care DNA diagnostics, food safety testing, and pathogen detection.
In Chapter 5, we present a PCR-free variable number of tandem repeat (VNTR) typing method with gold nanoparticle (AuNP)-DNA monoconjugates. Although the PCR method is considered as a gold standard method of nucleic acids analysis, it is a time-consuming and cost-inefficient process, and requires precise re-action control, leading to complicated microfluidic system covered in Chapter 3 and 4. Thus, we invented a PCR-free genetic analysis method that enables simple, robust, and fast VNTR. Firstly, the VNTR probe which consists of 5-nm Au NP for TEM observation, a ligation probe (30 bp) which hybridizes to the one repeat tan-dem sequence (16 bp) of VNTR locus, and a linker DNA for coupling between the AuNP and the ligation probe were synthesized using Click and thiol-gold chemistry. The synthesized VNTR probes are hybridized to the templates according to the repeat number of tandem region. If the template has two repeats, two VNTR probes can be hybridized. After ligation using T4 ligase, TEM analysis was performed. Based on this, the number of AuNP in a little cluster means the repeat number of the VNTR locus. We used the synthetic tem-plate mimicking the human D1S80 VNTR locus of which repeat number ranges from 2 to 4. As a result, the VNTR typing without PCR could be carried out successfully within 90 min. 2 to 4 repeat range of the locus could be identified by counting the AuNP number in a little cluster with accuracy and simplicity. This novel method provides proof-of-concept for PCR-free genetic analysis methods, leading to cost-efficient, fast, and simple processes for DNA diagnosis.
중합효소연쇄반응법 (polymerase chain reaction, 이하 PCR)은 목표 유전자를 선택적으로 다량 증폭이 가능하게 하는 반응으로 분자생물학을 비롯한 의료진단, 미생물 분석, 법의학, 식품안전 등 다양한 분야에 걸쳐 없어서는 안될 중요한 분석도구로 사용되어 오고 있다. 최근에는 PCR을 칩 상에서 수행함으로써, 경제적이면서도 고속 분석이 가능하고, 소형화에 유리한 휴대용 유전자분석기기로 발전시키려는 노력이 이어지고 있다. 이러한 휴대용 유전자분석기기는 Point-of-Care (POC) test, 감염성 병원균 및 전염성 질환의 신속 진단, 인간 ID 확인, 생물자원의 발굴 및 보호, 신속한 식품병원균 분석 등 다양한 분야에 응용될 수 있으므로 그 파급효과가 매우 크다고 할 수 있다. 하지만, 기존의 PCR을 칩상에서 수행하는 랩온어칩 (Lab-on-a-chip) 개념의 마이크로디바이스의 경우, PCR을 수행하게 하는 주변장치와 PCR 후의 유전자 분리 또는 분석에 필요한 장치가 모두 기존의 Table-top machine을 사용함으로서 소형화가 필요하며 다중 유전자 분석의 경우 정확도와 효율면에서 한계를 가지고 있다. 따라서 본 연구에서는 유전자 증폭 및 분리 분석이 모두 하나의 칩 위에서 가능한 통합형 마이크로 디바이스 구현을 목표로 하였으며, 칩 구동을 위한 주변 장치 및 분석을 위한 광학 장치 모두 소형화를 통해, 휴대용 유전자 분석기기로서의 플랫폼을 제공하고자 하였다. 이를 위해, PCR후에 증폭된 유전자 분석에 가장 널리 이용되고 있는 모세관전기영동법 (capillary electrophoresis, 이하 CE)과 마이크로어레이 (이하 microarray)방법에 맞춘 마이크로디바이스를 각각 디자인하였다.
첫 번째로, PCR과 CE가 통합된 PCR-CE 마이크로디바이스를 제작하였다. PCR-CE 마이크로디바이스는, PCR-CE를 위한 microchannel이 패턴된 지름 4인치 글래스웨이퍼 층, 온도감지를 위한 Ti/Pt전극이 집적된 글래스웨이퍼 층, micropump작용을 위한 poly(dimethylsiloxane) (이하 PDMS) membrane 층과 membrane의 압력조절을 위한 manifold글래스 층으로 구성된다. 더불어, 칩의 구동을 위한 전자회로, solenoid밸브, 기압펌프, 고전압공급기가 모두 10x21x24 cm 상자크기로 소형 집적화 되었다. 더불어, 유전자의 형광신호를 감지하기 위한 형광검출장치 또한 소형화되었다. DNA샘플이 포함된 PCR반응용액은 2 μL 용량의 마이크로 PCR chamber로 들어가며, 저항온도전극 (Ti/Pt)을 이용하여 온도센싱을 하여, PCR반응에 필요한 thermal cycling을 수행하게 된다. PCR반응 후에 증폭된 유전자는 전기영동에 의해 CE 마이크로채널로 이동하며, matrix로서 poly(acrylamide)가 채워진 채널을 따라 이동하면서, 분리가 일어나며, 분리채널의 끝에서 소형 형광검출장치를 이용해 유전자의 형광신호를 검출하게 된다. 이 통합형 PCR-CE장치를 이용하여 11개의 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, 이하 SNP)을 타이핑하였다. 목표로한 11개의 SNP는 한우 특이적 마커로서 수입우로부터의 한우판별을 위해 선별되었으며, MassARRAY 분석결과 4개이하로 SNP증폭산물이 검출될 때에 601두의 한우중 100%가 모두 한우로 판명되었으며, 382두의 수입우 중 362개가 5개 이상의 SNP 증폭산물로 보여 95%의 정확도를 보이는 마커로 판명되었다. 이러한 11개의 다중 SNP 분석을 위해 형질특이적 PCR 방법 (allele-specific PCR, 이하 AS PCR)을 이용하였으며, 이를 통합형 PCR-CE 마이크로칩에서 분석하였다. 결과로서 통합형 PCR-CE 유전자 분석장치에서 80분 이내에 다중 SNP분석을 고속으로 수행할 수 있었다.
두번째로, 통합형 PCR-CE 마이크로디바이스와 더불어, 통합형 PCR-microarray칩을 제작하였다. 통합형 PCR-microarray chip은 두 부분으로 구성된다. micropump-PCR-micromixer 기능이 통합된 PCR-micromixer chip과 일회용으로서 PCR-micromixer칩에 탈부착이 가능한 microarray chip이다. PCR-micromixer chip의 구조는 PCR-CE chip과 유사하다. 하지만, 유체흐름을 조절하기 위한 micropump와 micromixer채널이 각각 PCR chamber 앞 뒤에 집적되었다. Microarray칩은 10개의 한우 특이적 SNP 증폭산물을 포획할 수 있는 probe가 심어져있으며, 이 위에 얇은 PDMS 지지체를 붙혀 이를 PCR-micromixer chip에 붙힐 수 있도록 설계하였다. DNA 샘플을 포함한 PCR반응용액이 PCR cham-ber에서 thermal cycling 과정을 거치며, 반응 후 micropump를 통해 주입된 혼성화 버퍼와 증폭산물이 micromixer채널에서 혼합된다. 이렇게 만들어진 샘플은 역시 micropump를 통해 microarray chip으로 주입되어 1시간 혼성화 반응 후 휴대용 형광 스캐너장치를 통해 검출하게 된다. PCR-CE chip 과 동일하게 모든 조작은 S/W를 이용하여 laptop에서 자동화되었다. 또한 1시간 걸리는 혼성화 반응을 micropump를 이용한 대류를 이용하여 30분까지 반응시간을 줄일 수 있었다. 결과로서, 10개의 SNP 증폭산물을 단일칩 위에서 성공적으로 분석할 수 있었다. 본 연구에서 개발한 휴대용 유전자 분석 시스템은 하나의 칩 위에 DNA의 증폭 및 분리 검출이 모두 통합된 장치로서, 구동을 위한 전기회로 및 광학장치 또한 소형화 시킴으로써, 고속 고효율 유전자 분석이 이동형 시스템으로 가능하다는 것을 증명하였다. 이러한 마이크로디바이스를 이용하여 한우 판별뿐 아니라, 유전적 질병과 관련된 인간 SNP 다중 분석, 감염성 병원균, 호흡기 감염질환, 수인성 병원균의 현장 진단 등이 가능할 것이며, 더 나아가 자가 유전자 진단 시스템을 비롯한 POC Chip 으로의 응용을 위한 플랫폼으로도 제공될 수 있을 것이다.
마지막으로, 금 나노입자와 DNA 혼성체를 이용하여PCR 반응 없이 유전자의 가변성 연쇄반복구간 (variable number of tandem repeat, 이하 VNTR)을 분석하였다. PCR 자체가 유전자 분석에 있어서, 높은 정확도와 민감도를 가지는, 널리 이용되는 방법이긴 하지만, 비교적 시간이 오래걸리고, 고비용이 소요되는 방식이며, 본 연구의 마이크로시스템 구축에 있어서도 복잡한 칩 디자인과 비교적 큰 외부장비를 필요로 하므로, 휴대용 시스템 구축에 있어서도 단점으로 작용할 수 있는 분석법이다. 따라서, 본 연구에서는 간편하고 빠른 유전자의 VNTR을 분석할 수 있는 방법을 개발하였다. 먼저 VNTR 분석을 위한 탐침은 투과전자현미경 분석을 위한 5-nm 금 나노입자와 VNTR의 반복구간에 혼성화되는 라이게이션 탐침 (ligation), 금 나노입자와 라이게이션 탐침을 연결하여 주는 링커 DNA, 3부분으로 구성된다. 라이게이션 탐침과 링커 DNA는 Click chemistry를 이용하여 연결하였으며, 금 나노입자는 링커 DNA의 끝의 thiol 기능기를 이용하여 부착하였다. 최종 합성된 VNTR 탐침은 유전자의 VNTR 반복구간의 반복횟수에 따라 2개의 반복구간에는 2개의 VNTR 탐침이, 3개의 반복구간에는 3개의 탐침이 붙어 ligation 된다. 투과전자현미경 분석을 통해 이렇게 붙은 VNTR 탐임의 금 나노입자 개수를 세어, 단순히 눈으로 봄으로서 VNTR의 반복횟수가 몇 번인지를 분석할 수 있게 된다. 이러한 PCR 반응을 없앤 유전자 진단 방법은 높은 정확도를 가지면서도90분 이내 고속으로 수행이 가능하였다. 결과적으로, 제안된 방법은 PCR 반응을 없앰으로서 저가의 간편한 유전자 고속 분석의 기본 개념을 제공하게 될 것이다.
