The detection of mismatched base pairs in DNA plays a crucial role in the diagnosis of genetic-related diseases and conditions, especially for early stage treatment. Among the various biosensors that have been used for DNA detection, EC sensors show great promise because they are capable of precise DNA recognition and efficient signal transduction. Par-ticularity specific application of enzymatic activity or electrochemical reagent for detection strategies have enabled for the development of highly sensitive, highly specific sensors making them attractive for the detection of small sequence variations.
In the first strategy described in chapter 2, we developed a novel electrochemical method for SNP genotyping on the peptide nucleic acid (PNA)-modified electrode utilizing single-stranded DNA specific endonuclease. By using the strategy, we are able to success-fully detect various mutations including single base insertion, deletion, and substitution in BRCA1 gene for several real human samples from breast cancer patients. This study serves as a totally novel strategy for the electrochemical diagnosis of human genetic mutations ex-hibiting reliable discriminating power between wild type and mutant samples. The signifi-cance of the work derives from the following features.
1. This is the first report to utilize and combine the unique neutrality of PNA molecules and the delicate single-stranded DNA specific cleavage activity of nuclease S1 for the de-velopment of a new label-free electrochemical method for SNP genotyping. By ingeniously designing a novel strategy utilizing the electric charge property and distinctive cleavage ac-tivity, innovative label-free signaling detection was achieved and cumbersome extra-procedures for signaling were successfully eliminated, which are usually required for the previous electrochemical methods for SNP genotyping.
2. Since electrochemical method has many advantageous characteristics including sim-plicity, portability, and cost-effectiveness, our detection system is expected to hold great promise for mutation detection or SNP genotyping in facility-limited environments or min-iaturized point-of-care testing (POCT) applications.
3. Since we demonstrated the feasibility of our method by successfully detecting three representative types of base mutations including single base insertion, deletion, and substi-tution in BRCA1 gene using real human genomic samples, our method is considered to be just ready to be practically applied in clinical diagnostic field beyond just academic verifi-cations or demonstration like in the previously reported studies.
In Chapter 3, label-free and washing-free electrochemical DNA detection methods for the diagnosis of sexually transmitted disease (STD) caused by Trichomonas vaginalis, Herpes simplex virus type2 and Chlamydia trachomatis are described. The procedures utilize a reaction catalyzed by a peroxidase-mimicking DNAzyme to produce an insoluble precipitation layer on the surface of electrode. DNAzyme combined with hemin forms a self-assembled G-quadruplex structure which takes the nature of peroxidase activity. Thus, formed G-quadruplex catalyzes 4-chloronaphthol producing insoluble product on electrode surface. Analysis is performed using faradaic impedance spectroscopy. Only when DNAzyme sequence located in capture probe remains single strand DNA with (scheme 3-2 and scheme 3-3) or without (scheme 3-1) hybridization of complementary target, the im-pedance values are greatly increased owing to the catalytic action of G-quadruplex. By em-ploying this strategy, target DNA from real patient sample was reliably detected within 20 min without time-consuming and labor-intensive secondary labeling step of signal probe and washing step. This strategy based on peroxidase-mimicking DNAzyme can be a remarkable rapid and simple electrochemical method for the DNA detection.
In chapter 4, plant virus pathogens were detected with rapidity and simplicity based on property of methylene blue (MB) binding to DNA, employed as an electrochemical sig-naling reagent, by utilizing electrochemical real-time PCR system. On the electrode-patterned glass chip, PCR was performed and the cathodic peak currents were simultane-ously recorded by measuring the square wave voltammogram (SWV). Since rate of electro-chemical reaction of free MB decreased after formation of MB-intercalated DNA complex, the current signal was drawn distinct decrease with an increase in the PCR cycle number. Even a noticeable signal difference of current showed up within 10 cycle of PCR taking time 30 min. Hence, this method can be a highly attractive tool for simple and rapid in-field plant virus diagnosis that is likely to make an impact in the future.
바이오센서 분야에서 전기화학 분석 방법은 전기화학적 활성 물질의 산화/환원으로부터 발생한 신호를 측정하는 방법으로써, 분석장비가 저렴하고, 장비의 소형화가 용이하여 향후 POCT (point of care testing) 등을 위한 lab-on-a-chip을 구현하기에 가장 적합한 분석 방법이다. 검출하고자 하는 물질의 전기화학적 산화/환원 반응으로부터 직접적으로 신호를 발생하거나, 전자전달물질 (electron mediator) 등을 이용하여 간접적으로 신호를 발생하는 방식으로 전기화학적 센서를 구현할 수 있으며, 보다 빠르고, 간단하고, 정확하게 목적 물질을 검출할 수 있도록 전극 설계 및 최적화된 검출반응을 위한 전체 시스템을 디자인하는 것이 핵심 기술이다.
본 연구에서는 다양한 효소활성을 이용하고 전기화학적 분석방법을 적용하여 유전자 변이진단을 성공적으로 수행하였다. 첫 번째로 한가닥 특이적 핵산내부절단효소를 이용하여 3종의 유전자 변이(insertion, deletion, substitution)에 의한 유방암을 진단하였고, 다음으로 과산화효소활성을 가진 핵산효소 염기서열을 이용하여 병원균에 의해 감염되는 성병(Trichomonas vaginalis(TV), Herpes simplex virus type2(HSV2) and Chlamydia trachomatis(CT)) 3종을 진단하였다. 마지막으로 핵산증폭효소를 이용하여 실시간으로 식물바이러스 진단이 가능한 5종의 식물바이러스(Squash mosaic virus (SqMV), Melon necrotic spot virus (MNSV), Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV), Zucchini green mottle mosaic virus (SGMMV) and Kyuri green mottle mosaic virus (KGMMV)) 진단칩을 개발하였다. 이와 같은 주제들을 아래와 같이 간략히 요약하였다.
제 2장에서는 전기화학적 분석방법을 적용하여 검출전극표면이 띠고 있는 전하의 차이를 이용하여 유전자 변이에 의한 유방암을 성공적으로 진단하였다. 검출전극표면에 음전하를 가지고 있는 핵산이 존재할 경우에는 음전하를 띠고 있는 전자전달물질이 전극표면에서 핵산과의 정전기적 반발현상에 의해 전극표면으로 접근하지 못하게 된다. 따라서 전자전달물질의 산화/환원에 의해 발생된 전자는 검출전극표면을 통해서 전달되지 못하여 핵산이 반응한 후에는 검출되는 전기적 신호가 감소하는 점을 이용하였다. 먼저 전극 표면에 자체 전하가 없는 유사핵산 물질인 PNA (polypeptide nucleic acid)을 고정화한다. 이때 전극 표면은 중성전하를 띠고 있기 때문에 음전하를 띤 전자전달물질은 자유로이 전극표면에 접근하여 산화/환원반응으로 인해 발생되는 전자를 원활히 전달하고 이에 따른 전기적 신호가 검출된다. 다음으로 고정화 되어 있는 PNA와 상보적인 결합을 이루는 핵산(검출하고자 하는 목적핵산) 또는 상보적 결합을 하지 못하는 핵산을 각각 반응시킨다. 다음으로 한가닥 특이적 핵산내부절단효소를 처리하여 각각 전극에서의 전기화학적 검출신호를 측정한다. 전극표면에서 PNA와 상보적 결합을 하는 핵산의 경우는 완벽한 이중가닥을 이루고 있기 때문에 한가닥 특이적 핵산내부절단효소와의 반응에도 변화가 없고 따라서 전극표면은 여전히 혼성화된 핵산으로 인해 음전하를 띠게 된다. 따라서 음전하를 띠고 있는 핵산과 음전하를 띤 전자전달물질 사이에는 정전기적 반발력으로 인해 전자전달물질은 전극표면으로 접근하지 못하게 되고 따라서 전기적 신호가 감소하게 된다. 반면, 상보적 결합을 하지 못하는 핵산의 경우, PNA와 상보적 결합을 이루지 못하고 한가닥만 남아있던 핵산부분은 한가닥 특이적 핵산내부절단효소에 의해 절단되어 세척단계에서 제거되고 따라서 검출전극표면은 중성전하를 띤 PNA만 남게 된다. 따라서 전자전달물질은 자유로이 전극표면으로 접근하여 전극표면을 통해 전자전달을 원활히 하게 되고 핵산이 반응하기 전인 상태와 마찬가지로 동등한 전기적 검출신호를 보여준다. 이를 이용하여 유방암을 유발한다고 알려진 3종의 돌연변이가 발생한 실제 환자들로부터 얻은 유전자 시료를 분석하여 돌연변이가 발생한 시료와 그렇지 않은 정상 시료를 성공적으로 판별o진단할 수 있는 연구결과를 얻었다.
제 3장에서는 과산화효소 활성을 가지는 핵산효소 염기서열을 이용하여 목적핵산의 검출이 가능한 전기화학적 새로운 핵산검출방법을 개발하였다. 여기서 핵산효소는 헤민과 3차 구조를 이루어 단백질 효소와 구분되는 특유의 촉매활성을 가지는 핵산서열로써 이 핵산 효소는 단백질 효소보다 높은 열적 안정성, 간편한 합성 및 수식, 그리고 특정 서열을 인식할 수 있는 특성을 가지고 있다. 과산화효소 활성을 가지는 핵산효소 염기서열이 목적핵산 검출을 위한 반응용액에서 효소적 침전반응을 일으켜 검출전극 표면에 침전물을 생성시키고 이로 인한 전극표면 저항이 증가함을 이용하였다. 증가한 전극표면저항은 전기화학적 임피던스 분광법으로 측정하였는데 이러한 전기화학적 임피던스를 측정함으로써 수치적으로 결과값을 확인할 수 있고 장치의 소형화가 용이하며 검출하고자 하는 목적핵산의 유무를 단일단계로 간단하게 측정할 수 있는 장점이 있다. 이 연구를 통해서 다양한 목적핵산을 단시간으로도 간단하게 확인할 수 있으며, 일반 병원이나 숙련된 기술자가 없는 경우에도 손쉽게 사용될 수 있고 나아가 현장진단 관련 장치 및 시스템에 응용할 수 있다는 장점이 있다.
제 4장에서는 실시간으로 유전자의 연쇄중합효소반응(PCR, polymerase chain reaction)에 의한 핵산(DNA)증폭을 전기화학 방법으로 검출할 수 있는 신호발생 방법을 이용하여 식물바이러스를 실시간 PCR 증폭과 동시에 전기적 신호측정이 수행되어 실시간으로 식물바이러스를 검출할 수 있는 식물바이러스 5종에 대한 진단 칩을 성공적으로 개발하였다. 먼저 핵산과 반응할 수 있는 전기활성물질인 메틸렌블루(methylene blue)와 식물바이러스 RNA로부터 추출한 핵산을 이용해 연쇄중합효소반응을 진행하고 이 반응이 진행됨에 따라 핵산의 농도 변화에 따른 전기화학적 신호를 측정하였다. 연쇄중합반응이 진행될수록 증폭되는 핵산농도가 증가하고, 따라서 반응용액 내에 있던 증폭되는 핵산과 반응하는 전기활성물질 메틸렌블루는 줄어들게 된다. 그러므로 메틸렌블루의 산화/환원반응으로 인해 발생되는 전기적 신호가 핵산반응이 진행됨에 따라 줄어들게 되는 원리를 이용하였다. 또한 이 실험을 위해서 진단 칩의 핵심 요소인 전극의 디자인 및 설계, 전극 상에 반응 chamber 설계, 전극 상의 PCR 수행 최적 조건을 성공적으로 확립하여 5가지 각각의 식물바이러스를 실시간으로 검출할 수 있는 진단칩을 개발하였다.
