Successful differentiation and expansion of endothelial cells (ECs) from embryonic stem cell (ESC)-derived Flk1+ mesodermal precursor cells (MPCs) requires supplementation of vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A). While analyzing VEGF-A/VEGFR2 downstream signaling pathway that underlies the VEGF-A-induced differentiation and ex-pansion of ECs, we fortuitously found that Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor Y27632 profoundly promoted the differentiation and expansion of ECs from Flk1+ MPCs, while reducing the differentiation and expansion of mural cells. The ROCK suppression-induced expansion of ECs appears to have resulted from promotion of proliferation of ECs via activation of PI3-kinase-Akt signaling. The ECs obtained by the combination of ROCK suppression and VEGF-A supplementation faithfully expressed most pan-EC surface mak-ers, and phenotypic analyses revealed that they were differentiated toward arterial EC. Fur-ther incubation of the ICAM2+ ECs with Y27632 and VEGF-A for 2 days promoted expansion of ECs by 6.5-fold compared to those incubated with only VEGF-A. Importantly, the ROCK suppression-induced ECs displayed neovasculogenic abilities in vitro and in vivo. Thus, supplementation of ROCK inhibitor Y27632 along with VEGF-A in 2D Matrigel culture system provides a simple, efficient, and versatile method for obtaining ample amount of ESC-derived ECs at high purity suitable for use in therapeutic neovascularization.
Flk1+ 중배엽 전구 세포에서의 효과적인 혈관 내피 세포 분화와 그 증식에는 VEGF-A의 공급이 필수적이다. 이에 본 연구에서 VEGF-A에 의한 혈관 내피 세포 분화 도중 VEGF-A/VEGFR2 신호 전달 체계의 하위 신호 기작을 분석하는 도중, ROCK의 억제제인 Y27632가 중배엽 전구 세포의 혈관 내피 세포 분화를 촉진하는 동시에 혈관 벽 세포의 분화를 감소 시킴을 확인 하였다. 연구 결과 ROCK 억제에 의한 혈관 내피 세포의 분화 증가는 PI3K-Akt 신호 전달 체계의 활성화에 다른 혈관 내피 세포의 증식 촉진에 기인함을 확인하였고, 반대로 MyPT-MLC 신호 전달 체계를 저해해서 혈관 벽 세포의 분화를 감소 시킴을 확인하였다. 본 연구에서 얻어진 혈관 내피 세포들의 세포 표면 인자들을 살펴본 결과 대표적인 혈관 내피 세포 표지 인자들이 세포 벽에 발현하고 있었으며, 특히 동맥혈관 표지 인자들을 다량 발현하고 있어 동맥혈관에 가깝게 분화한 혈관임을 확인하였다. 또한 세포표면의 ICAM2 발현을 이용해 순도 높은 혈관 내피 세포를 분리하는데 성공하였으며, 정제한 혈관 내피 세포들을 VEGF-A와 Y27632와 함께 2일간 추가 배양하여 VEGF-A 단일 처리군 보다 약 6.5배의 혈관 내피세포들을 얻을 수가 있었다. 특히, 분화한 EC들은 생체 내 또는 외에서 완벽하게 기능성을 보임을 확인할 수가 있었다. 결과적으로 본 연구에서는 VEGF-A와 Y27632의 조합을 통하여 이차원 Matrigel 배양법을 사용하여 간단하고 효율적이면서도 다방면에서 응용 가능한 혈관 내피 세포 분화 방법을 확립하였으며 그를 통해 고농도의 혈관 내피 세포의 다량 분화에 성공하였다. 이는 추후 치료용 혈관 내피 세포 생성에 사용될 수 있을 것으로 사료 된다.