Concerns over the increasing emergence of antibiotic-resistant pathogenic microor-ganisms due to the overuse of antibiotics and the lack of effective antibiotics for livestock have prompted efforts to develop alternatives to conventional antibiotics. Antimicrobial peptides (AMPs) with a broad-spectrum activity and rapid killing, along with little oppor-tunity for the development of resistance, represent one of the promising novel alternatives. Their high production cost and cytotoxicity, however, limit the use of AMPs as effective antibiotic agents to livestock. To overcome these problems, we developed potent antimicrobial Escherichia coli displaying multimeric AMPs on the cell surface so that the AMP multimers can be converted into active AMP monomers by the pepsin in the stomach of livestock. Buf IIIb, a strong AMP without cytotoxicity, was expressed on the surface of E. coli as Lpp-OmpA-fused tandem multimers with a pepsin substrate residue, leucine, at the C-terminus of each monomer. The AMP multimers were successfully converted into active AMPs upon pepsin cleavage, and the liberated Buf IIIb-L monomers inhibited the growth of two major oral infectious pathogens of livestock, Salmonella enteritidis and Listeria monocytogenes. Live antimicrobial microorganisms developed in this study may represent the most effective means of providing potent AMPs to livestock, and have a great impact on controlling over pathogenic microorganisms in the livestock production.
항생제의 오남용으로 인한 항생제 내성균주의 증가는 전세계적인 문제로 대두 되었고, 특히 가축에서의 인수 공통 항생제의 사용이 점차적으로 전면 금지됨에 따라 기존의 항생제를 대체 할 수 있는 항생 물질의 개발이 시급하다
항균 펩타이드는 자연계에 존재하는 거의 모든 생명체가 외부 침입균으로부터 자신을 보호하기 위해 1차적 방어물질로 생산하는 물질로 체내 면역 기능에도 중요한 역할을 한다. 항균 펩타이드는 다양한 균들에 활성을 보이고 반응 시간이 매우 빠르며, 기존의 항생제와는 차별화된 기작으로 내성을 일으키기 어려워 차세대 항균물질로서 주목 받고 있다. 그러나 화학합성으로 인한 고비용이 요구되어 가축에서의 사용이 매우 제한적이다. 이들 문제를 해결하기 위해 본 연구진에서는 항균 펩타이드 중합체를 세포 표면에 발현하는 항생미생믈을 구축하였고, 항균펩타이드 중합체는 위에 있는 펩신에 의해 활성을 가지는 단량체 항균 펩타이드가 되도록 항생미생물을 개발하였다.
본 연구에서는 높은 농도에서도 cytotoxicity를 나타내지 않으며 단량체 상태에서는 펩신에 의해 내부 서열이 잘리지 않는 Buf IIIb 항균 펩타이드를 중합체로 제작하였을 때 펩신에 의해 잘릴 수 있도록 pepsin-cleavage amino acid를 첨가한 Buf IIIb-L를 디자인하였다. Buf IIIB-L은 중합체로 제작되어 Lpp-OmpA anchor protein에 fusion되어 대장균의 표면에 발현하여 가장 먼저 항생대장균이 구축되었고, 세포 표면에 발현된 펩타이드 중합체는 펩신에 의해 활성을 가지는 단량체로 잘려나와 가축에서의 가장 큰 질병원인이 되는 균주에 대한 활성을 보였다. 특히 세 개의 Buf IIIb-L중합체를 표면에 발현하는 대장균이 활성이 가장 좋았고, 1 x 1011 cells로부터 251.93 μg 의 recombinant Buf IIIB-L를 얻을 수 있었다. 다음으로 병원성 유전자를 포함하지 않는 최소유전체 대장균과 사람이 섭취하였을 때에도 안전하다고 알려진 미생물 균주 중에서 효모를 이용하여 동일한 방법으로 항균펩타이드 중합체를 발현시켜 보았을 때, 세포 표면에 이들 다중합체가 발현이 됨을 확인 할 수 있었다. 현재 이들의 활성이 실제 동물에서도 in vitro와 얼마나 차이가 있는지 확인하기 위해 mice를 이용한 in vivo 실험을 준비하고 있다.
이와 같은 항생미생물 시스템은 지금까지 생산에서의 고비용의 문제로 항균펩타이드를 실제 이용하지 못하였던 한계를 극복할 수 있는 가장 혁신적인 방법으로, 순수 분리 및 정제과정이 필요하지 않은 시스템으로써, 가축에서의 항균 펩타이드 이용에 의미 있는 발판을 제공하게 될 것이다.
