In this thesis, we focus on the nanometer resolution imaging of cells that are highly transparent. The conventional techniques for cellular imaging exploit inhomogeneities and bio-chemical characteristics of cells for phase and fluorescence microscopy, respectively. Phase microscopy is widely used for qualitative visualization of cellular structures in real time by using the inhomogeneities of height and refractive index without the need for specialized stains or dyes. The inhomogeneities make different optical path length deviation allowing high contrast imaging.
Recently, researchers are interested in quantitative phase microscopy that allows the nanometer accuracy measurements of optical phase length by using interferometric techniques. However, the conventional methods require precise optical alignment due to the heterogenous phase noise. Thus we propose novel self-reference quantitative phase microscopy to minimize the phase noise. We demonstrate the performance of the proposed quantitative phase microscopy using polymer structures and various cells. It is also readily applied to microfluidic devices for cell cultivation.
Additionally, fluorescence microscopy is applied to structural and functional imaging of cells by using staining of fluorescence proteins and dyes. However, the resolution of far-field optical microscopy is limited by diffraction limit. Recent breakthroughs in far-field fluorescence microscopy have achieved nanometer resolution imaging by exploiting non-linear properties of optical elements or fluorescence phenomena. In STED microscopy, two precisely aligned high power laser beams generate an effective nanoscale point spread function, and PALM/STORM applied photoswitchable fluorophores to achieve single molecule localization of high accuracy. These methods have a common principle that a sparse subset of fluorophore is switched on and off. Even though the conventional nanoscopy reach lateral resolution of 10 ∼ 20nm, they have to be applied with extraordinary techniques such as complicated optics, photoswitching molecules and localization algorithms.
Here, we present novel nanometer resolution microscopy using speckle illumination and array signal processing, which does not require photoswitchable fluorescent probes and extraordinary optical systems. If the emission signals from multiple targets are not coherent, then the targets can be resolved by array signal processing techniques. Without photoswitchable probes and specialized optics we can achieve the incoherency of target signals by using dynamic speckle illuminations. By simply modifying the conventional epi-fluorescence microscopy to generate dynamic speckle illuminations, conventional fluorescent dyes and proteins can be imaged at nanometer resolution using a conventional low power CW laser. After enough snapshots are acquired, we can reconstruct a nanometer resolution image. Finally, we demonstrate the proposed nanometer resolution microscopy using nano-patterns and subcellular structures of cells.
본 논문은 세포 영상화를 위한 광학 현미경에 대한 것으로서 기존 광학계의 한계를 넘고자 한다. 세포를 명시야에서 관찰해보면 투명해서 구조를 관찰하기 힘들고 소기관들은 수백 나노미터이하 크기로 되어있어서 이를 관찰하기에는 광학계의 회절한계에 부딪히게 된다. 기존 광학 현미경에서 세포를 관찰하는 방법은 위상 현미경과 형광 현미경을 이용하여 관찰이 가능하다. 위상 현미경의 경우 세포내부의 굴절률이 균일하지 않고 각 기관의 크기 및 세포의 두께가 균일하지 못해서 발생하는 위상차를 염색을 하지 않고 실시간으로 관찰 가능하다는 장점이 있다. 하지만 기존 위상 현미경의 경우 정성적인 영상만을 제공하기 때문에 최근에 정량적 위상 현미경에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 간섭계를 기반으로 하는 정량적 위상 현미경의 경우 시편에 의한 위상 지연이 광학계의 정밀도에 의존하게 된다. 따라서 광학적 구성이 간단하여 빛의 경로차에 따른 잡음 발생이 최소화되는 자기기준을 가지는 간섭계를 이용하여 새로운 정량적 위상차 현미경을 제안하였다. 제안된 방법은 확장된 심도의 구현이 가능하여 초점이 맞지 않는 시편의 영상을 원거리에서 보정하여 깨끗한 정량적 위상 영상을 구현할 수 있다. 제안된 방법을 검증하기 위해서 마이크로 비드, PDMS 패턴과 마이크로 채널 내부에 존재하는 다양한 세포를 이용하였다. 형광 현미경은 세포 내부의 소기관이나 특정 단백질을 면역형광염색 방법을 이용하여 영상화한다. 특정 소기관 혹은 단백질에 대한 영상화가 가능하므로 세포내부에서 이러한 물질의 위치를 확인할 수 있으나 확인 가능한 크기는 회절한계를 넘어서지 못한다. 최근 10년간의 연구에서 이러한 회절한계를 뛰어넘는 초고해상도 영상화 기법들이 소개되었다. 대표적으로 STED 이나 PALM/STORM과 같은 방법들이 있으며 이러한 방법들은 세포 내부의 구조적 혹은 기능적 영상들을 수십나노미터의 해상도로 제공하였다. 하지만 이런한 방법들은 공통적으로 형광물질의 비선형적인 상태천이가 가능하거나 가능하게 만들기 위한 조건이 필수적이고 일반적이지 않은 광학계의 구성을 필요로 한다. 따라서 이러한 초고해상도 현미경이 널리 사용되기 위해서 일반적인 형광 물질 및 단백질과 기존의 형광 현미경을 활용한 방법이 요구된다. 제안한 스페클 조명과 배열 신호처리를 이용한 초고해상도 나노현미경은 이러한 조건들을 만족한다. 비선형 상태 천이를 가지는 형광물질들의 통계적 특성은 동적 스페클 조명을 이용하여 구현된다. 충분한 측정 영상들로부터 각 형광 신호들의 상관관계를 이용하여 배열 신호 처리 기법중 MUSIC 방법을 활용하여 신호원의 위치를 추정하므로서 영상 문제를 신호 검출 문제로 생각할 수 있게 하였다. 초고해상도 영상에서 발생할 수 있는 추정 오류를 보정하기 위해 $l_\infty$-MUSIC을 제안하였고 제안한 나노현미경은 다양한 나노패턴과 세포들을 이용하여 검증하였다. 형광물질의 사용에 제한이 없으므로 다양한 면역염색방법과 형광 단백질들을 사용할 수 있었고 최대 65nm의 크기를 가지는 물체가 복원가능하다는 것을 보여주었다.
