The Ras small GTPase superfamily (small GTP-binding protein or small GTPases) control a variety of cellular behaviors including cell migration, cell-cell interaction, and development. Small GTPase acts as molecular switches by cycling different conformational states between GTP-bound active form and GDP-bound inactive form. The activation of small GTPases is mediated by guanine-nucleotide exchange factors (GEFs), which catalyze the exchange of GDP for GTP. Several GEFs were intensively studied in order to investigate their regulation of specific small GTPases. For example, FGD1 specifically activates Cdc42 and Tiam1 activates Rac1. In human genome, there are more than 150 small GTPases and about 100 GEFs. Although many groups have put a great effort in understanding the roles of GEFs in the regulation of small GTPases, little is known how a large number of GEFs control their specific small GTPases.
In this research, to study systematically the role of GEFs in the regulation of small GTPases, I used previously isolated human GEFs and dominant negative form of small GTPases. For this study, in addition, I isolated effector proteins for each small GTPases. To elucidate the relationship between GEFs and small GTPases, I took morphology analysis by fluorescent cell imaging and found 15 GEFs that induced cell morphological changes in NIH3T3 cells among 27 GEFs that I tested. To validate their regulation of specific small GTPases in live cells I used dominant negative small GTPases. From the main idea of analyzing the morphological assay, I selected subgroups of potential GEFs and -small GTPases that may regulate their specific cellular morphology, lamellipodia, filopodia, and stress fiber. In each subgroup, I found the target small GTPases for each GEF by the morphological analysis. Each GEF regulates small GTPases in an isoform-specific manner. Further analysis with several live cell imaging techniques supported our model for the mechanism of GEF-small GTPase regulation.
To prove the sequential activation for signal transduction in GEFs-small G-Effector, I show an activation of effector protein by activating GEFs by live cell imaging. These results suggest that the activation of GEF positively regulate target endogenous small GTPase causing the sequential activation of several effector proteins. TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope) analysis for GEF-small GTPase-effector signaling mechanism supported the model for the GEFs-small GTPases-effector hierarchy.
This study will lead us to better understanding of how the Rho subfamily of small GTPases is regulated by multiple Rho GEFs to induce cell morphological changes and related cellular signaling.
Small G 단백질은 세포의 이동 및 발생, 신호 전달 과정에서 중요한 역할을 하며, 따라서 small G 단백질의 유전자 변이나 그로 인한 잘못된 조절 메커니즘은 많이 연구되어온 분야이다. 세포의 정상적인 기능에 중요한 small G 단백질은 GEF, GAP, GDI에 의해 활성이 조절된다. 이 중 GEF 단백질은 small G 단백질을 활성화 시키는 역할을 하며, GEF 단백질의 비정상적인 활성 조절은 암 등 인간의 질병과 밀접하게 연관되어 있다. 인간 유전체 내에 GEF 단백질이 70여 개 이상이 존재함에도 불구하고 완전한 조절메커니즘 연구가 잘 되어있지 않고, 20여 개의 small G 단백질 중 Rac1, Cdc42, RhoA 세가지 단백질에만 연구가 집중되어 이루어지고 있다.
본 연구에서는 세포의 형태 변화를 통한 GEF와 small G 단백질의 상호관계를 밝혀냄으로써, 다양한 GEF가 존재하는 이유에 대해 설명하였다. 27개의 인간 GEF 단백질 중, lamellipodia, filopodia, stress fiber 세 종류의 세포 모양을 유도하는 GEF를 1차 스크리닝하여 15개의 GEF를 선별했다. 이러한 특정 세포 모양을 유도하는 신호전달과정을 방해하는 DN (Dominant negative) small G 단백질을 클로닝하여 GEF 단백질과의 관계를 세포형태 제어 여부로 2차 스크리닝을 하였다. 그 결과 GEF가 small G 단백질을 조절하는데 있어 isoform을 구별하는 메커니즘을 가지고 있다는 것을 확인하였다. 이렇게 isoform-specific 조절은 세포가 다양한 신호 전달 과정을 확립하는 하나의 방식일 것이라 추측했다.
이러한 연구는 GEF와 small G 단백질의 조절관계에 대한 정보를 제공함으로써, 차후 특정 GEF와 small G 단백질의 조절을 인위적으로 제어하여 인간의 질병을 치료할 수 있는 유용한 데이터가 될 것이다.
