A quantitative, reproducible, fast, and inexpensive multiplexed immunohistochemistry (IHC) system is critical for personalized cancer therapy. In this dissertation, we first present a novel parallel multiplexing method, microfluidic multiplexed immunohistochemistry (MMIHC) platform, for the quantitative pathological diagnosis of breast cancer. Two-step multilayer soft lithography was applied for various solutions control and regular IHC staining. In order to apply conventional thin-section tissues into on-chip without any additional modification process, a novel tissue slide-compatible assembler was developed for perfect compatibility of conventional IHC method. By using the apparatus enabling reversible seal between the device and a cellblock sample, not only perfect fluid control for various solutions was exhibited without any leakage, bubble formation and cross-contamination, but also conventional preservation manner of tissue specimens was guaranteed. In addition, microscopic images were quantitatively analyzed based on the Bayesian classification and the color distribution of immunohistochemical staining was represented by the expectation-maximization algorithm and the Gaussian mixture model with Matlab software.
Four predictive and prognostic biomarkers of breast cancers, ER, HER2, PR and Ki-67, were examined for various breast cancer cell lines including SK-BR-3, MCF-7, AU 565 and HCC 70. Microfluidic multiplexed immunocytochemistry (MMICC) platform enabled immunocytochemical staining of the four biomarkers on a cell block at one time. Expensive antibody consumption and ICC/IHC processing time were saved up to 200-fold and 10-fold, respectively. This benefit was acquired from the own microfluidics system and the reason could be explained by convective diffusion mass transport, receptor-ligand binding kinetics and reaction rate equations, corresponding to CFD simulation results.
In addition, the platform was also applied to patient tissue samples of breast cancers. The MMIHC platform realized investigation of four biomarkers on a tissue slide at one time. Although the biomarkers were examined in the areas in which cancer was most severe, a comparative study was essential to clarify whether the results from such a localized examination using the MMIHC platform could be considered representative of the whole tissue section. The results revealed that Kendall’s coefficient of concordance (KCC, n = 105) was 0.96 for ER, 0.90 for HER2, 0.95 for PR, and 0.98 for Ki-67, meaning that all of biomarkers showed very strong representative compared to conventional whole-section IHC method for tissue samples. Needle biopsy samples were chosen as a model to strengthen that the platform enables multiplexed IHC even in small-sized sample. Result showed that the platform was fairly worked on the core biopsy samples as well and the pathological scores were substantially concordant with the whole-section analysis.
To address the possibility of large-scale expansion of multiplexing and in situ quantification, quantitative IHC platform with 20 reaction channels was developed for a more sophisticated pathological diagnosis of molecularly heterogeneous diseases. Ten biomarkers were examined simultaneously on a single cell block. Results exhibited biomarkers’ expressions for breast cancer cell lines and quantitative proteomic profiling for 10 biomarkers.
The results presented in this dissertation indicate that this novel concept in IHC technology will enable histopathological diagnosis using numerous specific biomarkers at a time, thus facilitating the individualization of cancer therapy. In addition, the method is expected to be useful for identifying novel markers for classifying solid tumors, biomarker development for IHC, the selection of optimal biomarkers, and biological pathway studies.
면역조직화학은 조직검사에서 민감성과 특이성이 매우 높은 검사방법으로서, 암 진단 및 생물과학 연구 분야에 광범위하게 이용되고 있다. 그러나, 암 환자에게 있어서 정확한 진단을 통한 각 환자에게 적절한 약물 및 분자요법을 시행하기 위해서는 여러 표지자에 대한 검사를 수반해야 한다. 그러나, 환자의 한정된 조직 샘플과 조직샘플에서 절편제작 과정의 낮은 수율, 환자에게 부과되는 비용적, 시간적 문제 등으로 말미암아 여러 표지자에 대한 검사를 현재, 임상에 적용되지는 못하고 있는 실정이다. 뿐만 아니라, 수술 전 보조요법과 조기진단으로 말미암아 수술에서 얻어진 종양의 크기가 작아지고 있는 추세이기 때문에, 작은 시료에서 여러 표지자에 대한 검사의 필요성은 맞춤형 치료를 위한 필수조건이라 할 수 있다. 따라서, 본 연구는 다중 미세유체채널이 겸비된 장치를 조직절편 시료 위에 결합하고, 면역조직화학법에 필요한 유체의 주입, 반응 및 검사를 칩 상에서 미세유체채널을 통하여 구현하여 단일 조직절편의 시료만으로 다양한 표지자에 대한 검사를 실현할 수 있도록 하였다. 조직적합용 어셈블러를 개발하여 조직시료와 미세유체채널간의 인터페이스를 완료하였다. 이를 통하여 미세한 방울이나 누수 없이 완벽하게 복잡한 유체구동을 구현 할 수 있었으며, 조직시료에 손상이 없음을 확인하였다. 본 플랫폼의 특성평가 후, 4 종류의 유방암 세포주를 이용하여 다중 면역조직화학 검사가 이루어지는 것을 확인하였다. 유방암 검사에 대표적으로 사용되는 바이오마커, ER, HER2, PR, Ki-67는 하나의 셀블럭 위에서 한번에 검사가 이루어졌다. 본 연구에서는 정량적인 분석이 이루어질 수 있음을 확인하기 위하여 Western blot을 이용한 각 유방암 세포주의 바이오마커 정량결과와 비교해 보았다. 회귀분석을 해본 결과, 두 방법에 대해 큰 선형성을 보임을 알 수 있었으며, 본 플랫폼으로 단백질의 상대적 정량화가 가능함을 보였다. 또한, 반복성 특성평가를 기존 방식과 자동화 장비와 비교 하였는데, 본 플랫폼이 가장 반복성 특성이 우세함을 확인하였다. 본 플랫폼은, 약 200배의 항체 소비효과와 10배 가량의 소요시간 감소를 보였는데, 이는 본 미세유체제어기술의 특성으로 인한 항원-항체 반응의 효율이 높아졌기 때문이었고, 본 현상에 대해 수치해석적으로 설명하였다. 셀블럭을 통하여 본 플랫폼의 최적화 조건을 수립한 후에, 실제 유방암 환자의 시료에 본 플랫폼을 적용해 보았다. 105개의 실제 유방암 환자의 시료를 가지고 검사해 본 결과, Kendall’s coefficient of concordance (KCC)값이 ER, HER2, PR, Ki67 바이오마커에 대해0.96, 0.90, 0.95, 0.98 의 값을 가졌다. KCC값이 0.9이상일 경우에 통계적으로 거의 완벽한 일치성을 보인다고 알려져 있으므로, 본 플랫폼을 통하여, 유방암 면역조직화학에 본 플랫폼이 적용 가능함을 확인하였다. 본 플랫폼은 병렬적 직선 형태의 반응 채널부를 가지기 때문에, 반응 채널부에 어떤 순서로 바이오마커를 주입하느냐에 따라 결과가 달라질 수 있기 때문에, cyclical permuting test를 통하여 결과의 재현성을 확인해 보았다. 모든 바이오마커에 대해서 0.95 이상의 KCC 값을 가지는 것으로 보아, 본 플랫폼이 조직시료에 대해 높은 재현성을 확보함을 알 수 있었고, 가장 밀집된 암세포 영역에서 약간의 소자간의 배열 차이는 실험결과에 별 차이를 보이지 않음을 확인할 수 있었다. 또한, 본 플랫폼에서 희귀하거나 작은 조직시료에서도 다중 면역조직화학법이 가능함을 보이기 위하여, needle biopsy 시료에 대해서도 본 플랫폼을 적용해 보았는데, 본 시료에서도 네 가지의 바이오마커가 한번에 검사 가능함을 확인하였다. 또한, 본 연구의 컨셉이 더욱 많은 경우의 표지자 수로 확장 가능함을 보여주기 위하여, large-scale quantitative IHC platform 을 개발하였다. 20개의 반응 채널을 가지고 한번에 10개의 바이오마커를 동시에 검사할 수 있도록 고안하였으며, 암세포주를 통하여 실험해 본 결과, 기존의 결과와 잘 일치하면서도 10개의 표지자에 대해 한번에 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다. 이상에서 살펴본 바와 같이, 다중 면역조직화학 검사장치는 값비싼 항체의 소모를 기존방식에 비해 수 십배 이상 줄일 수 있어 비용적 절감을 기대할 수 있는 효과가 있다. 또한, 하나의 조직절편 시료로 다양한 표지자 검색을 통해 면역조직화학법이 가지는 절편제작의 낮은 수율 문제를 극복함과 동시에 암 환자의 여러 조직상태 정보의 확보로, 정확한 진단을 통한 최적의 약물 및 분자요법을 시행할 수 있는 효과가 있다.