In this study, the biosynthesis of poly(lactate) [PLA] homopolymer and poly(3-hydroxybutyrate-co-lactate) [P(3HB-co-LA)] copolymer in recombinant bacteria was carried out for the first time. Poly(lactide)s [i.e. poly(lactic acid)] and their copolymers are typical biodegradable polymers. Thus far, chemical synthesis of these polymers has been investigated and widely used in biomedical applications during the last decades (Fujita and Doi, 2003). However, biosynthetic concept of PLA and P(3HB-co-LA) in recombinant bacteria has never been tried. For the biosynthesis of PLA and P(3HB-co-LA), two key enzymes, propionate Coenzyme A [CoA] transferase from Clostridium propionicum and(or)PHA synthase from other bacteria, such as, Allochromatium vinosum and Bacillus cereus, were introduced into this biosynthesis system. The activity of these enzymes was confirmed in vitro by liquid chromatography-mass spectrometry [LC-MS] analysis and in vivo by gas chromatography [GC] analysis of poly(3-hydroxybutyrate) [PHB] biosynthesis in recombinant bacteria. Nuclear magnetic resonance [NMR] analysis showed qualitatively that PLA and P(3HB-co-LA) were accumulated in recombinant Escherichia coli [E. coli] and Wautersia eutropha [W. eutropha] by using lactate or lactic acid as a direct substrate. In addition, deletion of ldhA gene encoding (D)-lactate dehydrogenase, was done for the enhanced synthesis of P(3HB-co-LA) in recombinant E. coli. The newly biosynthetic PLA homopolymer and P(3HB-co-LA) copolymer need to be characterized against chemically synthesized polymers. The result of this study established the novel system for the bioconversion of producing the chemically synthetic PLA and its copolymers by using environment-friendly biotechnology.
폴리 락타이드(폴리 락트산)와 그것의 공중합체는 폴리하이드록시알카노에이트와 함께 대표적인 생분해성 고분자이다. 이들의 생체적합성과 구조적 안정성, 무(낮은) 독성과 같은 뛰어난 물성으로 인해 산업적으로나 생의학적으로 널리 사용되어져왔다. 특히, 폴리락트산과 그것의 공중합체는 조직공학과 약물전달 시스템에서 생체의료학적, 약학적 물질로서, 그리고 환경 오염을 줄이기 위한, 상업적인 플라스틱의 대체물로서 사용되어왔다. 따라서 지금까지 폴리락트산과 그것의 공중합체의 화학적 합성에 대한 많은 연구가 이루어져왔다. 반면, 폴리하이드록시알카노에이트는 다양한 (재조합) 미생물에서 그 생합성과 대량생산이 지난 수십 년 동안 연구되어왔다.
재조합 미생물을 이용한 폴리락트산 단일 중합체와 폴리락트산과 폴리하이드록시알카노에이트의 공중합체의 생합성은 지금까지 시도된 적이 없다. 이는 락트산과 같이 2번 탄소에 하이드록시기가 결합된 알카노에이트가 폴리하이드록시알카노에이트 중합효소의 기질 특이성에 적합하지 않다는 이전의 연구 때문인 것으로 보인다. 우리는 인 비트로 효소 활성 측정을 통해 락토일 코엔자임 에이에 작지만 반응성을 보이는 중합효소도 있다는 보고에 근거하여 기존의 폴리하이드록시알카노에이트의 생합성시스템을 이용하여 폴리락트산 단일 중합체나 폴리락트산과 폴리하이드록시알카노에이트의 공중합체를 합성할 수 있다고 보았다.
이를 위해서는, 우선, 두 개의 주요 효소, 프로피오네이트 코엔자임 에이 전달 효소와 폴리하이드록시알카노에이트 중합효소가 필요하다. 그리하여 이 두 효소들의 후보 효소들이 철저히 검토되어졌고, 재조합 대장균에서 폴리하이드록시부티레이트의 생합성을 통해 인 비보상에서 간접적으로 그 활성을 검증하였다. 검증된 효소들을 실제 시스템에 도입하였다. 첫 번째로, 혐기성 박테리아인 클로스트리듐 프로피오니쿰 유래의 프로피오네이트 코엠자임 에이 전달효소를 가지는 재조합 와우터시아 유트로파 균주의 두 단계 플라스크 배양을 통해 폴리3-하이드록시부티레이트와 락테이트의 공중합체가 생합성된다는 것이 핵자기공명 분석을 통해 정성적으로 확인되었다. 두 번째로, 클로스트리듐 프로피오니쿰 유래의 프로피오네이트 코엠자임 에이 전달효소와 알로크로마티움 바이노섬 유래의 폴리하이드록시알카노에이트 중합효소를 가지면서 락테이트 탈수소효소가 제거된 재조합 대장균 균주의 유가식 발효를 통해 역시 폴리3-하이드록시부티레이트와 락테이트 의 공중합체가 생합성된다는 것이 핵자기공명 분석을 통해 정성적으로 확인되었다. 이 때, 락테이트 탈수소효소의 제거는, 이 효소에 의한 락테이트를 파이루베이트로 전환시키는 반응의 차단을 통해, 보다 효율적인 락테이트 모노머를 포함한 고분자를 합성시키기 위함이다. 마지막으로, 클로스트리듐 프로피오니쿰 유래의 프로피오네이트 코엠자임 에이 전달효소와 바실러스 시리우스 유래의 폴리하이드록시알카노에이트 중합효소를 가지는 재조합 대장균 균주의 발효를 통해 폴리락테이트 단일중합체가 생합성된다는 것이 핵자기공명 분석을 통해 정성적으로 확인되었다.
이 연구에서는 대사적으로 조작된 박테리아 균주에서 폴리락테이트 단일중합체와 3-하이드록시부티레이트와 락테이트의 공중합체를 생합성하는 독창적인 시스템을 확립하였다. 이는 기존의 화학적으로 합성된 폴리락테이트와 그의 다양한 공중합체의 생산을 친환경적인 생물학적 합성으로 전환시키는 것을 의미한다. 더 나아가, 화학적 합성으로는 제한된, 생물학적으로 합성된 고분자의 고유한 특성으로 인해 폴리락테이트와 그의 공중합체들의 특성의 개량과 조절을 기대해 볼 수 있다.
