Charge-converting poly (amino acid)s derivative in response to acidic tumor environment was successfully derived. PHEA-g-C18 with a charge-converting property was designed by two significant steps, starting from polyaspartamide (PHEA) and including: (1) introduction of ethylenediamine groups via urethanic linkage; and (2) attachment of Dimethylmaleic acid (DMMA) in a basic condition. The obtained polymer had been verified to form a stable spherical micelle via TEM image, forming a well-defined structure, yet degrades well with the presence of proteolytic enzymes. The zeta potential value had converted from negatively-charged to positively-charged when it meets the acidic tumor extracellular environment. The results indicate that the charge conversion behavior would increase the cellular uptake, and moreover, decrease the unwanted protein adsorption under neutral condition. These proper-ties can further be applied as an early detecting module of cancer and become an advanced study of designing smart drug carriers for drug and gene delivery.
본 연구에서는 폴리아미노산 유도체인 Poly(2-hydroxyethyl aspartamide) 합성 한 후, 특정 산도에 따라 전하가 바뀌는 2,3-dimethylmaleic anhydride (DMMA)와 소수성인 octadecyl사슬을 곁가지에 접목시킨 양친성고분자를 합성하였다. 본 고분자는 자기조립현상을 통해 나노크기의 구형마이셀을 형성하였고, 특정산도에서 표면전하가 바뀌는 특성을 가지고 있다.
우선 아미노산의 한종류인 L-aspartic acid로부터 PSI를 acid-catalyst con-densation반응을 통해 PSI를 합성한 후, 적절한 양의 octadecylamine과의 aminolysis를 통해 원하는 정도의 octadecyl사슬을 접목시킨다. octadecyla-mine과 반응하지 않은 남은PSI단위는 ethanolamine과 반응시킴으로써 친수성의 PHEA를 고분자 백본으로 갖는 양친성 그래프트 공중합체가 합성하였다. 이후 PHEA-g-C18의 곁가지에 bis(4-nitrophenyl) carbonate 를 linker로 사용하여 ethylenediamine 을 도입하였다. 원하는 양의amine기가 도입된 후 그 말단에 염기의 pH환경에서 DMMA/SA를 부착시켰다. 이렇게 하여 pH에 따라 표면전하가 달라지는 양친성 고분자를 합성하였고, 물에 직접 용해하여 자기회합현상을 유도하였다. 합성한 고분자는 1H NMR과 GPC를 이용해 구조 및 분자량 확인을 하였고, 농도에 따라 임계 자기회합농도 (CMC, critical micelle concentration) 을 측정하였다. 또한 회합된 구조체의 크기와 모양을 TEM과 DLS를 통해 측정하였다. DMMA는 pH 환경이 중성(pH 7.4)에서 약산성(pH 6.8)로 바뀔 때 고분자 백본으로부터 탈착이 되기 때문에 고분자마이셀의 표면 전하가 음에서 양으로 바뀌는 특성을 가지고 있다. 이를 측정하기 위해 Zeta potential을 이용해 표면전하가 pH에 따라 바뀌는 특성을 측정하였다. 반면 그의 대조군인 SA는 어떠한 pH 환경에서도 고분자 백본에 붙어있어 표면전하가 음으로 유지되는 현상을 보였다. 우리 몸 속의 정상혈류는 중성의 pH (pH 7.4) 상태이며, 정상혈류 내에서는 음의 전하를 띠는 다양한 혈장 단백질이 존재한다. 그러므로 본 연구의 고분자 마이셀은 정상혈류에서는 전자기적 반발력에 의해 약물전달체와 혈장단백질이 응집되는 현상을 막아줄 것이고, 반면 산성 상태의 암세포 환경(pH 6.8)에 도달했을 시 전하가 특이적으로 바뀌어 전자기적 인력으로 암세포 내에 효과적으로 들어갈 것이다. 이후 생체 내 실용화 가능성을 판단하기 위해 생분해성 실험 및 암 세포주에 대한 항암특성을 살펴보았다. 생분해성 실험을 위해 고분자와 고분자 단백질 분해 효소인 papain 및 chymotrysin을 pH 7.4와 37.5°의 생체조건에서 각각 배양을 시킨 후, gas permeation chromatography를 통해 고분자가 작은 단편의 조각으로 분해되었음을 확인할 수 있었다. 또한 시간에 따른 분해 정도를 측정하기 위해 고분자와 단백질 분해효소를 시간 별로 채취하여 분자량의 감소를 확인하였다. MTT assay를 통해서 고분자가 세포독성을 띄지 않는 것을 확인하였고, 고분자 마이셀이 세포 내 효과적으로 유입되는 것을 유세포 분석기와 공초점 현미경으로 확인하였다. 이후 암세포의 산성환경에 전하가 특이적으로 바뀌어 세포 안에 약물이 효과적으로 전달되는 현상을 확인하고자 고분자 마이셀에 항암제를 봉입하여 세포독성을 측정하였다. pH 6.8 의 약산성환경에서 전하의 전자기적 인력으로 인해 약물이 효과적으로 전달되어 향상된 항암현상을 확인할 수 있었고, 이는 in vivo 에서도 여타 전달체에 비해 뛰어난 항암특성을 보일 것으로 예상한다.
