RecA protein mediates homologous recombination which is essential for maintaining genomic integrity and for generating genetic diversity. In presence of ATP (or ATP analogues), RecA protein binds to single-stranded DNA (ssDNA) to form a helical filament. The filament searches homologous region, and binds to complementary double-stranded DNA (dsDNA), then catalyzes the strand exchange process.
Here we present a novel hybridization method on microarray utilizing RecA protein. Conventional hybridization method on microarray chip requires a denaturation step to make double-stranded PCR products into single-stranded form that hybridizes to capture probes. However, in our strategy using RecA protein, double-stranded PCR products are directly hybridized to capture probe in isothermal condition without prior denaturation step. First, RecA protein binds to immobilized capture probe to form a helical filament. The resulting filament holds complementary double-stranded target PCR product together yielding a triplex strands. In our strategy, ATP and RecA protein affect each other and all the components for our study are optimized. Also capture probe length affected to homologous recombination property of RecA protein, so we discovered the optimum length.
Under optimized conditions, our RecA-assisted hybridization strategy shows reasonable results compared to the conventional hybridization method which required prior denaturation step. In addition, based on the fluorescence signal pattern, target STD pathogens can be successfully identified. Therefore, this concept provides very simple and efficient hybridization method between capture probe and double-stranded DNA on various microarray chip experiments in isothermal conditions.
RecA 단백질은 DNA 가닥 교환 반응을 촉진시키는 단백질 중의 하나이다. ATP가 존재할 때, RecA 단백질은 단일가닥 DNA와 결합하여 나선형 필라멘트를 형성한다. 이렇게 형성된 필라멘트는 단일가닥 DNA와 상동 사슬을 가지고 있는 이중가닥 DNA 시퀀스를 찾아 결합하여, DNA 가닥 교환 반응을 촉진시킨다.
본 연구에서는 이러한 RecA 단백질을 이용하여 마이크로어레이 위에서 새로운 혼성화 시스템을 개발 하였다. 기존의 혼성화 방법은 이중가닥인 PCR 산물을 단일가닥 형태로 바꾸기 위해 혼성화 전에 변성 과정을 필요로 한다. 변성 과정을 통해 PCR 산물이 단일가닥으로 형태가 바뀌면 마이크로어레이 위에 고정화되어 있는 표적 탐침과 혼성화가 이루어 진다. 하지만, 본 연구에서는 RecA 단백질을 사용하여 등온에서 PCR 산물이 표적 탐침과 즉시 혼성화가 이루어지도록 디자인하였다. ATP, 또는 ATP 유사체가 있을 때, RecA 단백질은 고정화된 표적 탐침에 결합하여 나선형 필라멘트를 형성한다. 이렇게 형성된 필라멘트는 상보적인 이중가닥 타겟 PCR 산물과 결합하여 삼중가닥을 형성한다. 본 연구에서 ATP와 RecA 단백질은 서로 영향을 주고, 본 연구에 쓰인 모든 구성요소들은 최적화하였다. 또한, 표적 탐침의 길이는 RecA 단백질의 가닥 교환 반응에 크게 영향을 주는 요소이며, 이 역시 최적화하였다.
본 연구는 마이크로어레이 시스템에서 RecA 단백질을 사용하여 혼성화 방법에 응용한 최초의 시도이다. 또한, 기존의 보고된 방법들과 비교하여 볼 때, 이중가닥 DNA를 단일가닥으로 변성시키는 과정을 필요로 하지 않고, 다른 추가 과정 없이 RecA 단백질, DNA, 및 ATP의 단순한 혼합만으로도 혼성화시킬 수 있는 장점을 가진다. 뿐만 아니라, 최적화된 상태에서 마이크로어레이 위에서의 RecA 단백질을 이용한 혼성화 방법은 기존의 혼성화 방법과 비교하였을 때, 비슷하거나 더 좋은 혼성화 효율을 보임을 확인하였다. 게다가, 형광 신호 패턴을 통해서 표적 STD 병원체 검출이 가능하다. 따라서 본 연구를 통해 고안된 RecA 단백질을 이용한 간편하고 빠른 혼성화 방법은 다양한 마이크로어레이 위의 혼성화 방법에 적용될 수 있을 것이다.
