Ginsenosides are biologically active compounds produced by ginseng plants that are reported to have their own individual health benefits. The interaction of the plant-microbe rhizosphere is potentially of great importance in that these two sustain each other in the environment. Although Ginsenoside possesses antifungal and antibacterial properties in the rhizosphere, some bacteria could keep growing to assimilate ginsenoside using glycosidase produced by themselves. To obtain glycosidase in this way, we screened novel bacterial strains by metabolizing ginsenosides from the rhizosphere soil of a wild-simulated ginseng. The microbial community was evaluated using a 16S rRNA multiplex 454 pyrosequencing approach.
This analysis revealed patterns of bacterial diversity similar to those reported for many other soils, and there were high levels of nitrogen-fixing bacteria and Methylotrophs. While members of the phyla Proteobacteria and Acidobacteria were the most abundant bacteria in comparison within phlyla level, the class Sphingobacteria in Bacteroidetes phylum was also included the most abundant group in comparison within class level.The predominant genera found were Methylotenera (phylum Proteobacteria), Bradyrhizobium (phylum Proteobacteria), Gemmatimonas (phylum Gemmatimonadetes), Rhodoplanes (phylum Proteobacteria) and Terrimonas (Phylum Bacteroidetes).
Through four rounds of screening, 20 strains were found to be able to transform major ginsenosides into minor ginsenosides. Some bacteria belonging to the Mucilaginibacter genus were able to convert ginsenoside Rb1, Rb2, Rc and Rd to the active metabolites C-K via F2, C-Y and C-Mc, respectively.
One of these, the strain Gh3-E5, was determined to have a ginsenoside conversion pathway through microbial transformation: Rb1 → Rd → F2 → C-K; Rb2 → C-O → C-Y → C-K; Rc → C-Mc1 → C-Mc → C-K. These results show that the strain Gh3-E5 contained several enzymes that hydrolyze, consecutively, the terminal glucopyranosyl, arabinopyranosyl and arabinofuranosyl moieties at the C-20 carbon and hydrolyze the terminal and inner C-3 carbons of ginsenoside Rb1, Rb2 and Rc.
Two new β-glucosidases from a novel strain of Mucilaginibacter sp. nov. GH3-E5 were cloned into E.coli for over
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expression and were purified by fast protein liquid chromatography. Two genes, bgl D2F3 and bgl D1F2, were located directly adjacent to each other and were deduced to have molecular masses of about 85kDa and to belong to the same families of glycosyl hydrolases 3. While Bgl-D2F3 catalyzed the hydrolysis of the two glucose moieties attached to the C-20 position of ginsenoside Rb1 and the outer glucose attached to the C-20 position Re and Rg1, Bgl-D1F2 could not convert anything at all. Bgl-D2F3 catalyzed the conversion of ginsenoside Rb1 to the more pharmacologically active ginsenosides Rg3(S) via Rd; it also catalyzed Re to Rg2(S) and Rg1 to Rh1(S). Furthermore biochemical analysis of the two recombinant proteins revealed that the enzymes exhibit different substrate specificities. While Bgl-D1F2 was only active in the hydrolysis of β-glucoside, Bgl-D2F3 cleaved β-glucoside and β-fucoside as well. The optimal pH values and temperature for Bgl D1F2 and Bgl D2F3 for hydrolysis from ρ-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside were determined to be pH6.0 and 37℃, and pH 5.0 and 40 ℃, respectively. The Km values of Bgl-D1F2 and Bgl-D2F3 were 0.713±0.15 and 0.023 ± 0.005 mM, the Vmax values were 0.033±0.01 and 0.031 ± 0.006 mmol·min-1·mg of protein-1 for ρ-NP- β-D-glucopyranoide. These results reveal that not all β-D-glucosidase were related to the hydrolysis of Ginsenoside and that Bgl-D2F3 can be considered as a very promising catalyst for Ginsenoside.
To compare the conserved regions that contribute to the catalysis of ginsenoside within strains of Mucilaginibacter genus, bgl-D2F3 gene-specific primers were designed based on three kinds of nucleotide homology sequences with M.kaistensis Bgl-Qm49-1 and two β-glucosidases, EFQ75505 and EFQ73649, from M. paludis. The strains that were isolated from the soil environmental sample, M. angelicae, M.dorajii, M.gossypii, Gsoil032, Gh2-F6 and Gh2-H1, were revealed to have not only similar activity for microbial the conversion of Ginsenoside Rb1 and Re to Rg3 and Rg2,respectively, but also to allow the detection of conserved regions through PCR. Our results demonstrate that the bgl-D2F3 gene relates to the selective conversion of ginsenoside and that it helps symbiotic life in the rhizosphere.
Finally, strain GH3-E5T was classified by using a polyphasic approach. Cells were Gram-negative, aerobic, non-spore-forming, non-motile, rod-shaped bacterium. On the basis of 16S rRNA gene sequence similarity, strain GH3-E5 T was shown to belong to the family Sphingobacteriaceae and class Sphingobacteria, and was related most closely to the strains of type Mucilaginibacter angelicae GG-w14T (98.5% similarity) and Mucilaginibacter gossypii Gh-67T (97.2%). The level of the 16S rRNA gene sequence similarity between GH3-E5 T and the type strains of the other species in the family Sphingobacteriaceae was less than 95.2%. The G+C content of the genomic DNA of strain GH3-E5 T was 45.2 mol%. Phenotypic and chemotaxonomic data (MK-7 as the major ubiquinone; iso-C15:0 and C16:1 ω7c and/or iso-C15:0 2-OH as the major fatty acids) supported the
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affiliation of strain GH3-E5 T to the genus Mucilaginibacter. The results of physiological and biochemical tests allowed genotypic and phenotypic differentiation of strain GH3-E5T from recognized Mucilaginibacter species. GH3-E5T is therefore considered to represent a novel species of the genus Mucilaginibacter, for which the name Mucilaginibacter ginsengihumi sp. nov. is proposed. The type strain is GH3-E5 T ( = KCTC 23566 T ).
인삼사포닌은 생물학적으로 약리 효과가 뛰어난 물질로 알려져 있으며 항암효과, 항전이작용, 혈액순환 개선 및 손상 된 피부 세포의 재생에 탁월한 효과 등이 여러 연구 결과를 통해 알려졌다. 인삼 근권 미생물들은 인삼사포닌의 항균, 항박테리아 작용에도 불구하고 공생하며 살아가는데, 이것은 인삼사포닌 대사경로에 관련하는 효소를 가지고 있기 때문이다. 이러한 분해효소, 그 중 특히 β-glucosidase를 가지고 있는 미생물을 얻기 위해 장뇌삼 밭의 근권 으로부터 스크리닝이 이루어졌으며 16s rRNA multiplex 454 pyrosequencing 방법을 이용하여 미생물 군집을 분석 하였다. 장뇌삼 근권의 미생물 분포는 기존에 알려진 다른 토양의 것과 비슷하였으며 질소고정 미생물과 Methylotrophs이 가장 많이 발견 되었다. Acidobacteria 와 Proteobacteria 문이 약80%를 차지 하였으며, Gemmatimonas (phylum Gemmatimonadetes), Methylotenera (phylum Proteobacteria), Bradyrhizobium (phylum Proteobacteria), Terrimonas (Phylum Bacteroidetes)의 속이 우세하게 발견되었다.
4번의 스크리닝 과정을 통해 20개의 인삼사포닌 전환 미생물을 선별하였으며, 그 중 Mucilaginibacter 속에 속하는 균주들이 Ginsenoside Rb1, Rb2, Rc 그리고 Rd 를 각각 F2, C-K, C-Y 그리고 C-Mc를 거쳐 최종산물인 C-K를 생산하였다. 그 중 GH3-E5의 인삼사포닌 전환 경로를 분석해 본 결과 Rb1→Rd→F2→C-K;Rb2→C-O→C-Y→C-K;Rc→C-Mc1→C-Mc→C-K 임을 알 수 있었으며, GH3-E5는 인삼사포닌의 3번, 20번 탄소의 glucopyranosyl, arabinopyranosyl ,arabinofuranosyl 기를 모두 분해 할 수 있는 효소를 가지고 있음을 알 수 있었다. 20번의 탄소를 선택적으로 가수분해하면 Rg3 와 Rg2, Rh1을 생산 할 수 있는데 이것들은 모두 약효가 뛰어나 의약적, 산업적으로 그 가치가 매우 높으므로 이의 효소의 정보를 얻기 위한 클로닝 및 정제, 특성분석을 진행하였다.
GH3-E5의 2개의 새로운 β-glucosidases를 찾았으며 이를pEt21-Mal vector에 클로닝 하여, Amylose column 과 DEAE cellulose column을 사용하여 정제하였다. 2개의 유전자, bglD2F3와 bglD1F2는 서로 인접하여 위치하였으며 분자량은 두 효소 모두 약 85kDa로 비슷하였으고, 같은 Glycoside Hydrolase Family 3에 속하는 새로운 효소 였지만, 각각의 활성은 다른 양상을 보였다. Bgl-D2F3는 인삼사포닌의 20번 탄소의 결합을 분해함으로 Rb1을 Rd를 거쳐 Rg3(S)로, Re를 Rg2(S)로, Rg1을 Rh1(s)로 전환 할 수 있지만, Bgl-D1F2는 인삼사포닌을 전혀 전환 할 수 없었다. 게다가 2개의 재조합 효소의 기질 특이성 및 생리적 특성도 다르게 나타났는데, Bgl-D1F2는 오직 β-glucoside 결합만 분해 할 수 있지만, Bgl-D2F3는 β-glucoside 뿐만 아니라 β-fucoside 도 분해 할 수 있었다. 또한 효소 반응 적정 pH 와 온도도 ρ-NP-β-D-glucopyranoide 를 이용하여 측정한 결과 Bgl-D1F2는 pH6.0, 37℃, Bgl-D2F3는 pH5.0, 40.0℃ 이고, Km과 Vmax 값도 각각 0.713±0.15 과0.023 ±0.005 mM, 0.033 ±0.01 과 0.031 ± 0.006 mmol??min-1??mg for protein-1을 나타냈다. 이러한 결과는 모든 β-glucosidase가 인삼사포닌 전환에 관련하지 않음을 보여주며 본 연구에서 정제한 Bgl-D2F3의 높은 전환 활성은 그 의미가 매우 크다고 할 수 있다.
이러한 Bgl-D2F3 효소의 생태학적 역할을 규명하기 위해 bgl-D2F3 유전자의 특이적인 primer를 제작하였다. 기존의 Genome 정보가 분석된 M. paludis 의 2개의 β-glucosidase, EFQ75505 과 EFQ73649, 그리고 M.kaistensis 의 bgl-QM49-1를 이용하여 conserved region을 primer를 제작하여 Mucilaginibacter 속의 균주들로부터 PCR을 통해 유전자의 유무를 확인하였다. 그 결과 토양으로부터 분리 된 균주인 M.angelicae (HM627214), M.dorajii (GU139697), M.gossypii (EU672804), Gsoil032 (AB267718), GH2-F6, GH2-H1 에서는 유전자의 인삼사포닌 Rb1 과 Re의 전환도 Bgl-D2F3와 같은 양상을 보였지만, 다른 환경 샘플에서 분리 된 Mucilaginibacter 속 에서는 유전자도, 전환력도 관찰 되지 않았다. 이것은 bgl-D2F3 유전자가 인삼사포닌 전환에 결정적인 역할을 하며 인삼 근권 에서 공생하는 데에도 도움을 준다는 것을 알 수 있다.
Mucilaginibacter sp. nov. GH3-E5T는 16s rRNA의 유사성 분석 및 표현형과 화학 분류학적 분석을 통해 Mucilaginibacter 속에 속하는 신종 균주로 제안한다.
