Angiopoietin-1 (Ang1) plays a crucial role in vascular and hematopoietic development mainly through its cognate receptor Tie2. However, little is known about precise role of Ang1 in embryonic stem cell (ESC) differentiation. Here, using soluble and potent variant of Ang1, COMP-Ang1, we determined effect of Ang1 on endothelial and hematopoietic differentiation of mouse ESC in OP9 co-culture system. Strikingly, Ang1 drove endothelial differentiation from Flk-$1^+$ mesodermal progenitor cells, whereas it suppressed hematopoietic differentiation. These effects were mainly mediated through Tie2 signaling, which was evidenced by complete blockade of these effects by soluble Tie2-Fc. The Ang1-induced endothelial differentiation was resulted from enhanced endothelial cell (EC) survival rather than increased EC proliferation. We further determined the effect of Ang1 on CD$41^+$ cells, which were transiently appeared and differentiated into both endothelial and hematopoietic lineages. Intriguingly, Ang1 directed CD$41^+$ cells into endothelial differentiation rather than hematopoietic differentiation. Efficient in vivo neovascularization was obtained with the EC, which were expanded by Ang1 stimulation. In addition, Ang1 also drove endothelial differentiation from mouse induced pluripotent stem cell (iPSC) and human ESC. Taken together, Ang1/Tie2 signaling is a strong stimulator for differentiation and expansion of endothelial linage from ESC and iPSC.
배아줄기세포는 배아초기의 배반포에서 분리한 세포로서, 성체의 모든 세포로 분화가 가능한 다능성 (pluripotent) 및 무한히 증식을 할 수 있는 자가재생능력 (self-renewal)을 가지고 있다. 이러한 뛰어난 분화능 및 분열능으로 인해 배아줄기세포는 최근에 각광받고 있는 세포치료의 중요한 재료로서 많이 연구되고 있다. 최근에 성체세포를 역분화시켜 유도다능성줄기세포 (induced pluripotent stem cell) 를 만들 수 있는 기술이 개발되었다. 유도다능성줄기세포는 배아줄기세포와 거의 동일한 분화능과 분열능을 가지고 있을 뿐만 아니라, 이식시 면역거부반응을 회피할 가능성이 있어 배아줄기세포와 더불어 많은 연구가 진행되고 있다. 배아줄기세포 및 유도다능성줄기세포의 혈관내피세포로의 분화기전에 대한 연구는 향후 이를 통해 효율적으로 충분한 양의 분화된 혈관내피세포를 생산하여 이를 난치성 허혈질환 같은 질병의 치료에 적용하는 것뿐만 아니라 각종 의료기구 및 의료장비의 재료로 적용하는 등 무궁무진하게 응용 될 수 있다.
배아줄기세포가 혈관내피세포로 분화되는 과정을 보면, 우선 배아줄기세포에서 Flk-1양성 중배엽전구세포로 분화된 이후에 여러 전구세포단계를 거쳐 성숙한 혈관내피세포로 분화된다. Flk-1양성 중배엽전구세포는 혈관내피세포뿐만 아니라 조혈세포, 평활근세포 및 심근세포로 분화가 가능하다. 혈관내피세포 분화방법에는 크게 3가지가 있다. 첫째, 3차원적 세포군집인 embryoid body를 만들어서 분화시키는 방법, 둘째, OP9세포 위에 co-culture하는 방법, 셋째, collagen type IV를 코팅하고 그 위에 배양하는 방법이 있다. Embryoid body법은 혈관내피세포 분화율이 3%정도밖에 되지 않는데 반해 OP9법 및 collagen type IV법은 분화중간에 Flk-1양성 중배엽전구세포를 따로 분리하여 다시 분화를 유도하는 방법으로 분화효율이 약 15%정도 된다. OP9법은 혈관내피세포뿐만 아니라 조혈세포, 평활근세포 및 심근세포가 모두 유도되는 데 반해, Collagen type IV법은 혈관내피세포와 평활근세포만 분화유도되어 보다 선택적인 분화유도가 가능하다. 하지만, 분화과정에 대한 연구측면에서 혈관내피세포의 분화와 밀접한 관련이 있는 조혈세포의 분화를 동시에 연구할 수 없는 단점이 있다. 그러므로 혈관내피세포 분화과정에 대한 연구에는 OP9법이 보다 적합하다고 할 수 있다.
Angiopoietin-1은 Tie2수용체에 결합하여 혈관의 형성, 리모델링, 활성화에 작용한다고 알려져 있다. 최근에는 혈관 이외에 조혈줄기세포 및 근줄기세포에서의 기능도 연구된 바 있다. 또한 발생학적으로도Angiopoietin-1/Tie2 신호전달체계가 혈관 및 조혈세포 발달에 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있기는 하지만, 배아줄기세포의 분화에서 Angiopoietin-1의 자세한 역할에 대해서는 아직 연구된 바 없다. 하지만, Naive angiopioetin-1이 구조상 매우 불안정하기 때문에 Angiopoietin-1/Tie2 신호전달체계를 연구하는데 많은 어려움이 있었다. COMP-Ang1 (Ang1) 은 Naive angiopoietin-1의 N-terminal부분을 cartilage oligomeric matrix protein (COMP) 로 재조합하여 안정적인 pentameric 구조를 유지하도록 만든 재조합단백질로서, Naive angiopioetin-1에 비해 훨씬 안정적이고 강력한 활성을 지니고 있다. 따라서 Ang1을 이용하여 Angiopietin-1/Tie2 신호전달체계의 역할에 대한 연구를 진행하였다.
배아줄기세포를 Flk-1양성 중배엽전구세포로 분화시키고, Flk-1양성 중배엽전구세포를 분리하여OP9세포위에 3일간 co-culture를 시행하였다. Ang1 200 ng/ml을 OP9 co-culture시기에 처리하였을 때, CD144양성 혈관내피세포 군집이 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. Ang1을 농도별로 처리하여 보았을 때 50 ng/ml부터 의미있게 효과가 나타나기 시작하여 200 ng/ml에서 최대효과가 나타났다. soluble Tie2-Fc (sT2) 를 처리하여보았을 때, Ang1의 효과가 완전히 차단되는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, sT2를 단독으로 처리한 경우에도 혈관내피세포의 분화가 상당히 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 최근에 Tie2수용체 이외에 integrin을 통한 angiopoietin-1의 작용에 대해서 연구된 바 있어, pan-integrin inhibitor인 RGD peptide를 처리해본 결과, Ang1의 효과를 전혀 차단되지 않았다. 결국, Ang1이 Tie2수용체 신호전달을 통해 혈관내피세포의 분화를 촉진하고, 또한 혈관내피세포분화에 내인성 angiopoietin-1이 어느 정도 작용하고 있음을 알 수 있었다.
시간대별로 최대 6일까지 혈관내피세포 분화를 분석하여보았을 때, 대조군에서는 혈관내피세포 비율이 시간이 지나면서 줄어드는데 비해, Ang1을 처리한 경우에는 시간이 지나면서 혈관내피세포 비율이 점점 늘어나는 것을 확인할 수 있었다. 조혈세포 분화의 경우에는 1.5일째에 초기단계의 조혈세포의 표지자로 알려진 CD41양성 세포가 양군 모두에서 비슷하게 발생하고, 3일째에 CD45양성 조혈세포가 양군 모두에서 비슷하게 나타나며, 6일째에는 Ang1처리군에서 CD45양성 조혈세포의 비율이 현저하게 감소하는 것을 알 수 있었다. 이를 통해 Ang1이 Flk-1양성 중배엽전구세포에서 혈관내피세포로의 분화는 촉진하면서, 조혈세포로의 분화는 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
분화과정에서 혈관내피세포의 분열능 및 세포사멸률에 대한 Ang1의 효과를 확인해본 결과, Ang1을 처리한 경우, 2일에서 2.5일사이에 mitosis의 표지자인 phosphohistone H3양성 혈관내피세포가 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 3일째에는 세포사멸의 표지자인 annexin V양성 혈관내피세포가 감소하는 것을 확인 할 수 있었다. 따라서 Ang1이 혈관내피세포 분화과정에서 혈관내피세포의 분열은 촉진하고 세포사멸은 억제하는 것을 알 수 있었다.
OP9 co-culture 1.5일째 분화된 세포들에서 혈관내피세포 및 조혈세포 관련 표지자들의 발현을 분석해본 결과, 약 15%의 세포에서 혈관내피세포 표지자 (CD31, Tie2) 및 조혈세포 표지자 (CD41, Sca-1, c-kit) 가 동시에 발현하는 것을 확인 할 수 있었다. 이 시기의 CD41양성 세포들을 분리하여 다시 새로운 OP9세포위에 co-culture시행해본 결과, CD41양성세포에서 혈관내피세포와 조혈세포가 모두 분화하는 것을 확인할 수 있었다. 이 과정에서Ang1를 처리한 경우, CD41양성 세포의 대부분은 혈관내피세포로 분화하였으며, sT2를 처리한 경우에는, 대부분 조혈세포로 분화하였다. 이를 통해 Ang1이 Tie2수용체 신호전달에 의해서 분화초기의 CD41양성세포를 조혈세포보다는 혈관내피세포로 분화유도 한다는 것을 알 수 있었다.
Ang1으로 유도된 배아줄기세포 유래 혈관내피세포 (Ang1-EC-ESC) 를 분리하여 분석해본 결과, 형태학적으로 성숙한 혈관내피세포의 모양을 띄고 있었으며, 혈관내피세포 표지인자의 발현도 성숙한 혈관내피세포와 유사하였다. 또한 in vi-tro tube formation 및 이식시 in vivo 혈관형성능도 확인할 수 있었다. 마지막으로 Ang1을 유도다능성줄기세포 및 인간배아줄기세포의 분화에 적용하여 보았을 때에도 역시 혈관내피세포로의 분화를 증가시키는 것을 확인하였다.
정리하면, Ang1은 Tie2수용체 신호전달을 통해 배아줄기세포의 혈관내피세포분화를 촉진하고 조혈세포의 분화를 억제한다. 이러한 작용은 Ang1이 혈관내피세포의 분열능 및 생존능을 증가시키고, 뿐만 아니라 분화초기의 CD41양성 세포를 조혈세포보다는 혈관내피세포로 분화를 유도함으로써 이루어진다. 또한 Ang1은 유도다능성줄기세포에도 동일하게 혈관내피세포유도능을 증가시킨다. Ang1으로 유도된 배아줄기세포유래 혈관내피세포는 성숙한 혈관내피세포와 여러가지 측면에서 비슷한 성질을 보이며, 생체내 이식시 혈관형성능을 확인할 수 있었다.
본 연구 결과는 Ang1을 이용하여 혈관내피세포 분화를 보다 효율적으로 개선한 것이다. 또한 혈관내피세포 및 조혈세포의 분화에서 분화초기의 CD41양성세포의 분화능에 대해서 새롭게 분석하고, 이에 대한 Ang1의 역할을 규명함으로써 혈관내피세포 및 조혈세포분화연구에 중요한 정보를 제공하였다. 나아가 Ang1을 이용한 효율적인 혈관내피세포 분화를 통해 향후 세포치료를 비롯한 세포응용의학에 대한 연구에 보탬이 될 수 있을 것이다.