Angiopoietins are a family of vascular growth factors that collaborate with members of the vascular endothelial growth factor family to regulate vascular and lymphatic vessel growth, acing via the endothelial receptor tyrosine kinase, Tie2. Among of vascular endothelial growth factors, angiopoietin-1 (Ang1) has potential therapeutic applications in enhancing endothelial cell survival and preventing vascular leakage. However, high-level expression of Ang1 is hindered by the aggregation and insolubility of the protein due to its unique structure of Ang1. To avoid problems of aggregation and insolubility of Ang1, COMP-Ang1 was developed by replacing an N-terminal portion of Ang1 with a short coiled-coil domain of cartilage oligomeric matrix protein (COMP). The COMP-Ang1 is found to be more potent than native Ang1 for therapeutic angiogenesis in vitro and in vivo. However, its aggregation was still detected at a later phase of batch culture of recombinant CHO (rCHO) cells expressing COMP-Ang1 although aggregation was less significant than that of Ang1.
Protein aggregates usually exhibit reduced or no biological activity, and often lead to immunogenicity. Therefore, aggregation of COMP-Ang1 during rCHO cell culture is undesirable and should be minimized.
For the first step of this research, we studied the effect of culture temperature and pH on cell growth and flag tagged COMP-Ang1 (FCA1) production. Cells were cultivated in a bioreactor at different culture pH (6.7, 6.9, 7.2, and 7.5) and temperatures (33 and 37℃). Lowering culture temperature suppressed cell growth, while maintaining high cell viability for a longer culture period. The specific FCA1 productivity (qFCA1) was increased at low culture temperature. Accordingly, the highest FCA1 concentration was obtained at pH 7.2 and 33℃, which was approximately 2.6-fold higher than that at pH 7.2 and 37℃. However, aggregates and a monomeric form of FCA1, which are undesirable because of their reduced biological activity and immunogenicity, were significant at pH 7.2 and 37℃. It was also found that the expression pattern of FCA1 was affected more significantly by culture pH rather than the culture temperature. FCA1 aggregation dramatically decreased at culture pH 7.5 regardless of culture temperature. Furthermore, a monomeric form of FCA1 was not observed. Taken together, optimization of culture temperature and culture pH (33℃ and pH 7.5) significantly improves the production of biologically active FCA1 with terameric or pentameric form from CHO cells.
Secondly, to enhance COMP-Ang1 production and reduce its aggregation, NaCl and/or sorbitol were used to raise medium osmolality in the range of 300-450 mOsm/kg. The specific productivity of COMP-Ang1, $q_{COMP-Ang1}$, increased as medium osmolality increased. At NaCl-450 mOsm/kg, the $q_{COMP-Ang1}$ was 7.7-fold higher than that at NaCl-300 mOsm/kg, while, at sorbitol-450 mOsm/kg, it was 2.9-fold higher than that at sorbitol-300 mOsm/kg. This can be attributed to the increased relative mRNA level of COMP-Ang1 at NaCl-450 mOsm/kg which was approximately 2.4-fold higher than that at sorbitol-450 mOsm/kg. Western blot analysis showed that COMP-Ang1 aggregates started to occur in the late-exponential phase of cell growth. When sorbitol was used to raise the medium osmolality, a severe aggregation of COMP-Ang1was observed. On the other hand, when NaCl was used, the aggregation of COMP-Ang1was drastically reduced at NaCl-400 mOsm/kg. At NaCl-450 mOsm/kg, the aggregation of COMP-Ang1 was hardly observed. Taken together, environmental culture conditions are critical for the aggregation of COMP-Ang1 and production.
Another attempt to increase COMP-Ang1 production and enhance pentameric portion, molecular chaperones, ERp44 and ERGIC53, were overexpressed in CHO cells producing COMP-Ang1. To investigate the effect of ERp44 and ERGIC53 on productivity of COMP-Ang1 in rCHO cells, we established recombinant cell lines by transfecting the expression plasmids pcDNA-ERp44, pcDNA-ERGIC53, and pcDNA 3.1-Zeo (+) as control vector.
Specific HuCA1 productivity of HuCA1-ERp44 and HuCA1-ERGIC53 cell lines was slightly increased compared to HuCA1-Null cells that was 1.2-fold increase, while HuCA1 production and qHuCA1 of HuCA1-ERp44-ERGIC53 cell line was not influenced. In addition, Molecular chaperone overexpression did not affect on HuCA1 expression pattern.
To maximize foreign therapeutic proteins ranging from antibody to growth factors in industry, chemical chaperones such as glycerol, DMSO, sodium butyrate (NaBu) have been reported. Finally, we investigated with chemical chaperones on the production and aggregation of flag-tagged COMP-Ang1 (FCA1) in recombinant Chinese hamster ovary (rCHO) cells, CHO cells were cultivated in serum-free media with various chemical chaperones, 1 mM 4-phenylbutyrate (4-PBA), 200 mM proline, 3% glycerol, 2% dimethyl sulfoxide (DMSO) and without chemical chaperone as control. The addition of chemical chaperones enhanced FCA1 production and specific FCA1 productivity, qFCA1. However, its effect on the aggregation of FCA1 was different among chemical chaperones. A significant reduction in the aggregation of FCA1 was achieved by the addition of 2% DMSO and 200 mM proline, not by the addition of 1 mM 4-PBA and 3% glycerol. Among chemical chaperones, DMSO was the most effective one in regard to enhancing the production and reducing the aggregation of FCA1. In control culture, the proportion of aggregates was 79.6% while it was only 29.5% at 2% DMSO. To evaluate the effect of chemical chaperones on the expression of molecular chaperones, real time quantitative PCR (qPCR) was performed. Over 2-fold increase in the mRNA level of ERp57 was observed by the addition of 200 mM proline, 3% glycerol and 2% DMSO. However, the addition of 4-PBA did not increase the mRNA level of ERp57. Unlike ERp57, the mRNA levels of GRP78, calnexin (CNX) and calreticulin (CRT) were nearly unaffected by the addition of chemical chaperones.
Angiopoietin들은 혈관내피세포에서 특이적으로 발현하는 Tie2 receptor를 통해 혈관과 림프관의 성장을 조절하는 혈관세포성장조절인자 그룹이다. 혈관세포 성장조절인자들 중에서 Angiopoietin-1 (Ang1)은 혈관내피세포의 survival과 혈관이 세는 것을 막아주는 기능이 있어 치료용 목적으로 사용될 수 있는 가능성을 가진 물질이다. 하지만, Ang1의 특이한 분자구조적 특징으로 인해aggregation과 Ang1활성의 불안정성이 쉽게 유발되고, 이로 인해 Ang1의 고발현은 쉽지가 않다. Ang1의 aggregation과 불안정성의 문제점을 해결하기 위해, Ang1의 N-terminal 을 cartilage oligomeric matrix protein (COMP)의 짧은 coiled-coil 도메인으로 치환한 COMP-Ang1이 개발되어졌고, COMP-Ang1의 활성 및 효능은 여러in vitro와 in vivo실험을 통해 새로운 혈관생성에 있어서 native Ang1보다 더 효과적인 물질이라고 밝혀졌다. 그러나, COMP-Ang1을 발현하는CHO 세포에서 배양 후반부에서 여전히 aggregation이 확인 되었다.
일반적으로 단백질의 aggregation은 생물학적 활성을 줄이거나 또는 활성을 잃게 만들고 종종 면역반응을 일으키게 된다. 그러므로, CHO 세포 배양에서 COMP-Ang1의 aggregation은 원하지 않는 형태이고 또한 최소화 되어야 한다.
COMP-Ang1의 생산성을 증대시키고 aggregation을 줄이기 위한 첫 번째 단계로, 배양온도와 pH가 세포성장과 COMP-Ang1의 생산성에 미치는 영향에 대해 연구하였다. COMP-Ang1을 발현 하는 CHO세포를 pH 6.7, 6.9, 7.2, 7.5와 배양온도33℃와 37℃의 조합에서 bioreactor를 이용하여 배양하였다. 저온에서의 배양은 세포성장을 저해하였지만, 좀 더 긴 배양기간동안 세포 생존율이 높게 유지되었고, 단위세포당 생산성도 증가하였다. COMP-Ang1의 최고 농도는33℃, pH 7.2 조건에서 얻었고, 이것은 37℃, pH 7.2 조건에서 보다 약 2.6배 높았다. 그러나 pH 7.2에서 원하지 않는 COMP-Ang1의 aggregation과 monomeric 형태가 여전히 높게 발현되었다. COMP-Ang1의 발현 양상에 있어서는 배양온도보다 배양 pH가 크게 영향을 미치는 것으로 확인하였고, 배양 온도와는 상관없이 pH 7.5에서 크게 감소하는 것을 확인 하였다. 여려 가지 배양 조건 중에서 CHO 세포에서 최적의 COMP-Ang1의 생물학적 활성을 가지는 조건은 33℃, pH 7.5임을 알 수 있었다.
배지 삼투압도 치료용 단백질의 생산성과 단백질의 질에 영향을 줄 수 있는 또 다른 중요한 환경적인 요인이다. COMP-Ang1의 생산성을 증대시키고, 단백질의 aggregation을 줄이기 위한 두 번째 방법으로, NaCl과 sorbitol을 이용하여 배지 삼투압을 각각350-450 mOsm/kg로 증가시켰다. NaCl과 sorbitol에 상관 없이 배지 삼투압이 증가함에 따라 단위세포당 COMP-Ang1의 생산성도 같이 증가하였다. NaCl을 이용하여 배지 삼투압을 450 mOm/kg로 증가 시켰을 때 300 mOsm/kg 일 때보다 약 7.7 배 높았고, sorbitol을 이용하여 450 mOm/kg로 증가 시켰을 때도 300 mOm/kg일 때 보다 2.9배 증가하였다. 이것은 세포내의 COMP-Ang1의 mRNA level의 증가와 상관관계가 있는 것을 확인 하였다. Western blot 분석을 통해COMP-Ang1의 aggregation이 배양 후반부에 심하게 일어 나는 것을 확인 하였고, sorbitol을 이용하였을 때 보다 NaCl을 이용하였을 때 aggregation이 현저하게 감소하는 것을 확인 하였다. COMP-Ang1의 aggregation과 생산성에 환경적인 요인들이 중요한 요인으로 작용하는 것을 확인 하였다.
COMP-Ang1의 생산성을 증대시키고, pentameric 형태의 비율을 증대시키기 위한 또 다른 시도로 ERp44와 ERGIC53 molecular chaperones 을 COMP-Ang1을 발현하는 CHO 세포에서 고발현 시켰다. ERp44와 ERGIC53이 COMP-Ang1의 생산성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, COMP-Ang1을 발현하는 CHO 세포에 ERp44와 ERGIC53을 발현하는 각각의 vector를 transfection 시킨 후 HuCA1-Null, HuCA1-ERp44, HuCA1-ERGIC53, 그리고 HuCA1-ERp44-ERGIC53를 구축하였다. 하지만, 각각의 유전자를 발현 하였을 때는 단위세포당 COMP-Ang1의 생산성이 1.2배 증가하였지만, 두개의 유전자를 모두 발현하였을때는 오히려 감소하였다. 또한 ERp44와 ERGIC53 고발현은 COMP-Ang1의 발현 양상에는 영향을 미치지 않았다.
항체부터 치료용 단백질과 같이 외부 단백질의 생산성을 최대화하기 위하여, glycerol, DMSO, NaBu와 같은 chemical chaperone이 많이 이용되어져왔다. 마지막으로, COMP-Ang1을 발현하는 재조합 CHO 세포에 chemical chaperone이 생산성과 aggregation에 미치는 영향을 확인 하기 위하여, 여러 가지 chemical chaperone을 이용하여 무혈청 배지에서 배양하였다. 1mM 4-PBA, 200mM Proline, 3% glycerol, 2% DMSO 그리고 chemical chaperone이 없는 대조군을 가지고 실험하였다. chemical chaperone의 첨가는 COMP-Ang1의 생산성과 단위세포당 COMP-Ang1생산성을 증대시켰다. 그러나 COMP-Ang1의 aggregation에 미치는 영향은 chemical chaperone에 따라 달랐다. 2% DMSO와 200mM proline을 첨가 했을 때COMP-Ang1의 aggregation이 현저하게 줄어들었으나, 1mM 4-PBA와 3% glycerol을 첨가했을 때는 COMP-Ang1의 aggregation에는 크게 영향을 미치지 않았다. chemical chaperone들 중에서 DMSO를 첨가했을 때 COMP-Ang1의 생산성을 증대시키고 aggregation을 감소 시킴에 있어서 가장 효과적이었다. 대조군과 비교해 볼 때 COMP-Ang1의 aggregation의 비율이 79.6%에서 29.5%로 현저하게 감소하였다. 또한 chemical chaperone이 molecular chaperone에 미치는 영향을 확인하기 위하여 real-time PCR을 이용하여 확인 하였고, 200mM Proline, 3% glycerol, 2% DMSO 첨가 시 ERp57의 mRNA 발현이 약 2배 정도 증가 하였지만, 1mM 4-PBA 첨가 시에는 크게 변화가 없었다. ERp57의 mRNA 발현과 달리 chemical chaperone의 첨가에도 GRP78, CNX, CRT는 크게 영향을 받지 않았다.
