During recombinant Chinese hamster ovary (rCHO) cell culture, various events, such as feeding with concentrated nutrient solutions or the addition of base to maintain an optimal pH, increase the osmolality of the medium. To examine the effect of hyperosmolality on therapeutic protein production, an interferon-β (IFN-β)-producing cell line was cultivated in hyperosmotic condition. For efficient production of native IFN-β in rCHO cell culture, the IFN-β molecular aggregation that occurs during culture needs to be minimized. To do so, we investigated the effect of hyperosmolality and hypothermia on IFN-β production and molecular ag-gregation. Both hyperosmolality (470 mOsm/kg) and hypothermia (32℃) increased specific native INF-β productivity (qIFN-β). Furthermore, they decreased the IFN-β molecular aggregation, although severe IFN-β molecular aggregation could not be avoided in the later phase of culture. To overcome growth suppression at hyperosmolality and hypothermia, cells were cultivated in a biphasic mode. Cells were first cultivated at 310 mOsm/kg and 37℃ for 2 days to rapidly obtain a reasonably high cell concentration. The temperature and osmolality were then shifted to 32℃ and 470 mOsm/kg, respectively, to achieve high qIFN-β and reduced IFN-β molecular aggregation. Due to the enhanced qIFN-β and delayed molecular aggregation, the highest native IFN-β concentration achieved on day 6 was 18.03 ± 0.61 mg/L, which was 5.30-fold higher than that in a control batch culture (310 mOsm/kg and 37℃). Taken together, a combination of hyperosmolality and hypothermia in a biphasic culture is a useful strategy for improved native IFN-β production from rCHO cells.
The hyperosmotic condition has detrimental effect on cell growth despite its merit in qp. To determine the effect of hyperosmotic stress on apoptosis, type I programmed cell death (PCD), and autophagy, which can be type II PCD or a survival mechanism, of rCHO cells, two rCHO cell lines, producing antibody and erythropoietin, were subjected to hyperosmotic stress resulting from NaCl addition (310-610 mOsm/kg). For both rCHO cell lines, hyperosmolality up to 610 mOsm/kg increased cleaved forms of PARP, caspase-3, caspase-7, and fragmentation of chromosomal DNA, confirming the previous observation that apoptosis was induced by hyperosmotic stress. Concurrently, hyperosmolality increased the level of accumulation of LC3-II, a widely used autophagic marker, which was determined by Western blot analysis and confocal microscopy. When glucose and glutamine concentrations were measured during the cultures, glucose and glutamine concentrations in the culture medium at various osmolalities (310-610 mOsm/kg) showed no significant differences. This result suggests that induction of PCD by hyperosmotic stress occurred independently of nutrient depletion. Taken together, autophagy as well as apoptosis was observed in rCHO cells subjected to hyperosmolality.
Upon nutrient depletion during rCHO cell batch culture, cells are also subjected to apoptosis and au-tophagy. To investigate the effect of nutrient supplementation on the two processes and protein production in rCHO cells, an antibody-producing cell line was cultivated in batch and fed-batch modes. The feed medium containing glucose, amino acids, and vitamins was determined through flask culture tests and used in bioreactor cultures. In the bioreactor cultures, the nutrient feedings extended the culture longevity and enhanced antibody production. Also, cells in the fed-batch culture showed delayed onset of both apoptosis and autophagy, compared with those in the batch culture. The inhibition of apoptosis was demonstrated by decreased amount of cleaved caspase-7 protein and less fragmentation of chromosomal DNA. Concurrently, reduced LC3 conversion, from LC3-I to LC3-II, was observed in cells which received the feeds. Cultivation with pharmacological autophagy inducer or inhibitor indicated that autophagy is necessary for the cells to survive under nutrient depletion. Taken together, the delayed and relieved cell death by nutrient supplementation could improve the antibody production.
To investigate the effect of Bcl-$x_L$ overexpression on apoptosis, autophagy, and productivity in rCHO cells under hyperosmolality, an EPO-producing cell line was subjected to hyperosmolality resulting from NaCl addition (batch) and nutrient supplementation (fed-batch). Bcl-$x_L$ overexpressing cells showed delayed onset of both apoptosis and autophagy during hyperosmotic batch culture, compared with those without Bcl-$x_L$ overexpression. The inhibition of apoptosis was shown by decreased amount of cleaved caspase-7 and PARP. Concurrently, reduced LC3 conversion, from LC3-I to LC3-II, was observed in cells which overex-pressed Bcl-$x_L$. Thereby, the cell viability and EPO production were improved by Bcl-$x_L$ overexpression. The simultaneous application of Bcl-$x_L$ overexpression and nutrient feeding showed the better increase in the cul-ture longevity and maximum EPO concentration. Taken together, the delayed cell death by Bcl-$x_L$ overexpression could improve the EPO production in rCHO cells under hyperosmolality.
In conclusion, hyperosmolality, which can be induced by feeding with concentrated nutrient solutions or the addition of base to maintain an optimal pH during recombinant rCHO cell culture, can enhance the therapeutic protein production by increasing $q_p$ and delaying molecular aggregation and with relieving hyper-osmotic stress through Bcl-$x_L$ overexpression.
재조합 CHO세포 배양 중, 농축 영양분 용액의 첨가 또는 최적 pH를 유지하기 위한 염기의 첨가 등의 일로 인하여 배지 내 삼투농도가 증가한다. 고삼투 환경이 치료용 단백질 생산에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 인터페론베타 (interferon-β)를 생산하는 세포주를 고삼투농도의 배지에서 배양하였다. 인터페론베타 단량체를 효율적으로 생산하기 위해서는 인터페론베타의 집합화현상을 최소화시켜 주어야 한다. 그래서 고삼투농도와 저온을 배양에 적용하여 인터페론베타의 생산과 집합화현상에 미치는 영향을 조사하였다. 고삼투농도 (470 mOsm/kg)와 저온 (32℃)에서의 배양 모두 인터페론베타의 비생산성 (qIFN-β)을 증가시키고 인터페론베타의 집합화현상을 지연시켜 주었다. 하지만, 인터페론베타의 집합화현상을 배양 후반기까지 계속 억제하지 못함을 관찰하였다. 고삼투농도와 저온 배양에서의 성장 저해를 막기 위하여 이단계배양을 수행하였다. 310 mOsm/kg과 37℃에서 이틀간 배양하여 고농도의 세포 농도를 얻은 후, 비생산성을 높이고 집합화현상을 낮추기 위하여 삼투농도를 470 mOsm/kg, 온도를 32℃로 바꾸어 주었다. 그 결과, 대조군 환경 (310 mOsm/kg, 37℃)보다 5.3배 높은 18.03 mg/L의 인터페론베타 단량체를 배양 6일째에 얻을 수 있었다. 이와 같이, 고삼투농도와 저온을 이용한 이단계배양은 재조합 CHO세포에서 인터페론베타 단량체를 생산하는데 있어 효과적이었다.
고삼투 환경은 비생산성을 늘려주는 반면, 세포 성장을 저해한다. 고삼투 환경에 의한 스트레스로 인하여 세포내에서 세포예정사로 알려진 apoptosis와 autophagy가 어떻게 변화하는지를 알아보기 위하여, 두 종류의 재조합 CHO세포주를 염화나트륨 (NaCl)을 첨가한 배지 (310-610 mOsm/kg)에서 배양하였다. 항체와 적혈구 생성 촉진 인자 (EPO, erythropoietin)를 생산하는 두 세포주 모두 배지 내 삼투농도가 높아질수록 apoptosis의 표지인자인 PARP, caspase-3, 그리고 caspase-7의 분열을 증가시키고, 염색체 DNA의 절편화 또한 증가시켰다. 이와 함께, autophagy의 표지인자인 LC3의 I형에서 II형으로의 전환 또한 증가시킴을 Western blot과 공초점현미경을 이용하여 확인하였다. 배양기간 중, 포도당과 글루타민의 배지 내 농도는 삼투농도에 따라서 크게 다르지 않았다. 이 결과를 통하여 고삼투 환경에 의한 스트레스로 인하여 일어나는 세포 예정사가 영양분 고갈과는 독립적임을 확인할 수 있었다. 결과적으로, 고삼투농도에서 재조합 CHO세포는 apoptosis뿐만 아니라 autophagy도 겪는다는 사실을 확인할 수 있었다.
회분식 배양기간 동안 재조합 CHO세포는 영양분 고갈에 의하여 apoptosis와 autopha-gy를 일으킨다. 영양분 보충에 의하여 이 두 현상과 단백질 생산이 어떻게 변화하는지 알아보기 위하여, 항체 생산 세포주를 회분식과 유가식, 두가지 방법으로 배양하였다. 플라스크 배양을 통하여 포도당, 아미노산, 비타민을 포함하는 첨가 배지를 선정한 후, bioreactor배양을 수행하였다. Bioreactor배양에서 영양분을 첨가하여 주었을 때, 배양 기간이 증가하였고, 그로 인하여 항체 생산량 또한 증가하였다. 더욱이, 유가식 배양에서 회분식 배양에 비하여 세포 내의 apoptosis와 autophagy가 더 늦게 나타났다. Caspase-7의 분열과 염색체 DNA의 절편화 감소를 통하여 apoptosis의 저해를 확인하였고, LC3의 전환 감소를 통하여 autophagy의 저해를 확인하였다. Autophagy의 유도물질과 저해물질을 첨가한 배양에서 autophagy는 영양분이 고갈된 세포가 살아가는데 있어서 필요한 과정임을 확인할 수 있었다. 결과적으로, 영양분 첨가에 의하여 세포사멸이 지연, 감소되고 이로 인하여 항체 생산량이 증가함을 확인할 수 있었다.
항세포예정사 단백질인 Bcl-$x_L$의 과발현이 재조합 CHO세포의 apoptosis와 autophagy, 그리고 생산성에 어떤 영향을 끼치는지 조사하기 위하여, EPO를 생산하는 세포주를 이용하여 염화나트륨을 첨가한 회분식 배양과 영양분을 첨가한 유가식 배양에서 고삼투농도를 유도시켜 배양을 수행하였다. 고삼투농도에서 회분식 배양동안 Bcl-$x_L$이 과발현 된 세포에서 그렇지 않은 세포보다 apoptosis와 autophagy 둘 모두 더 늦게 관찰되었다. Caspase-7과 PARP의 분열 감소를 통하여 apoptosis의 저해를 확인하였고, LC3의 전환 감소를 통하여 autophagy의 저해를 확인하였다. 그로 인해, Bcl-$x_L$이 과발현 된 세포는 세포 생존율과 EPO 생산량이 개선되었다. Bcl-$x_L$의 과발현과 유가식 배양을 함께 이용했을 때, 배양기간과 최대 EPO 농도에서 더 큰 증가 효과를 나타내었다. 결과적으로, Bcl-$x_L$의 과발현으로 고삼투농도 배양에서 일어나는 세포사멸을 지연시킴으로써 EPO 생산을 개선시킬 수 있었다.
결론적으로, 재조합 CHO 세포 배양 중 농축 영양분 용액과 pH 유지를 위한 염기의 첨가 시에 발생할 수 있는 배지의 고삼투농도 환경은 목적 단백질의 비생산성을 높이고, 분자집합화현상을 지연시킴으로써, 그리고 이 때 발생하는 고삼투농도의 성장 저해 효과는 Bcl-$x_L$ 과발현을 통하여 완화시킴으로써 치료용 단백질 생산을 향상시킬 수 있었다.
