Recently, the demand for high speed high resolution optical measurement system is growing in numerous fields, for example, semi-conductor/FPD industries, bio-medical and surface/material sciences, etc. In order to meet the demand of these fields, many studies have been carried out. In order to overcome the resolution limit, many researchers have demonstrated new methods such as confocal, two-photon, stimulated emission depletion, 4Pi confocal, structured illumination microscopy, etc.
The resolution of conventional microscopy has been improved over the diffraction limits in struc-tured illumination microscopy (SIM). By using laterally SI in widefield, non-confocal microscope, it is possible to achieve lateral resolution well beyond the classical limit without discarding any emission light. However, a total of nine images are necessary. In order to double the axial as well as the lateral resolution with true optical sectioning, a total of fifteen images should be acquired. This leads the speed of the acquisition image to be slow and the process of the image reconstruction to be complex. Several researches have been carried out for increasing the image acquisition speed of SIM. However, actual real-time imaging of SIM is not performed yet.
In this thesis, the high speed high resolution cross structured illumination confocal microscope (CSICM) is proposed. The proposed CSICM obtain two times enhanced lateral resolution, optical sectioning ability and fast image acquisition speed. CSICM combines the cross SIM and the line beam scanning confocal microscope.
The cross SI pattern is generated by using the 2-D diffractive grating. Performances of the conven-tional SI and the cross SI are quantitatively compared by the analysis of the modulation transfer function. As a result, the cross SI method shows similar resolution to conventional SI method except along 45 degree and 135 degree directions. Since the cross SI method has no rotation of the grating or the specimen, fast SI pattern can be generated. The acquisition of a total of 6 raw images shortens the image acquisition time. Also, we prove that CSICM theoretically consists of SIM and the line scanning confocal microscope.
We analyze the error of the high speed high resolution CSICM. We introduce possible primary errors that can be predicted and calibrated. For shifting the phase of SI pattern, we move the diffractive grating me-chanically. The PZT actuator is used for the precise motion displacement. All PZT actuator have the limited motion resolution and the system alignment errors can occur. The PZT actuator that we use has a repeatability of 30 nm. The motion error of 30 nm does not give any artifact to the reconstructed image in CSICM. The cross SI pattern is created by using two pairs of cylindrical lenses and two pairs of linear polarizers. Two line SI patterns have the two linear polarization states orthogonal to each other. Since there is no interference between two line SI patterns and is independent on each other, it is possible to happen that two line SI patterns have different intensity/visibility. We analyze theoretically and compare quantitatively between the image spectra with and without intensity/visibility difference. We conclude that the different SI pattern intensity is calibrated by normalizing each image data for the same intensity ratio. Also it is concluded that the different SI pattern visibility does not affect the performance of the optical system, so it can be neglected. In the high speed high resolution CSICM, two galvano scanning mirrors with two axes are used. Each galvano mirror scans the line SI pattern on the specimen. Therefore, two scanning areas or two regions of interest (ROI) can be different. Until two images obtained from two CCD cameras are the same ROI, we should align the optical system well and adjust the input voltage signals for actuating two galvano scanning mirrors precisely.
The detail design of the proposed CSICM is achieved. In order to satisfy high speed and high resolu-tion, we use a laser with a wavelength of 488 nm. For the real-time imaging, the image acquisition speed should be specified at least 15 frames/s. For the high resolution, the industrial objective lens, which has a magnifica-tion factor of 100 and the numerical aperture of 0.95, is used. The lateral and the axial resolutions are theoreti-cally calculated as 157 nm and 895 nm, respectively. The number of image pixels is specified as 512 x 512, which is dependent on the line CCD camera. By rule of thumb, the field of view is 12 μm x 12 μm. The proposed CSICM consists of three optical systems, i.e. the pattern generation optics, the illumination optics and the detection optics. The designed CSICM has the value of RMS wavefront error lower than the diffraction limit. The result of spot diagram appears smaller size than the size of Airy disc. Therefore, we can consider that the optical system is well designed.
We implement and evaluate the optical system by measuring a lateral resolution, an axial resolution and an image acquisition speed. In order to obtain better performances, we compensate phase shift errors. The measured lateral and axial resolution are 0.172 μm and 1.02 μm, respectively, which are little poorer than theo-retical values, i.e. 0.157 μm and 0.895 μm. The image acquisition speed of CSICM is 4.8 frames per second in the case of a plane mirror. If we use high-power laser or very sensitive line CCD cameras, the real-time imaging can be accomplished. Also, we measure line and space objects with various periods of 150 nm, 200 nm 250 nm and 500 nm. A line and space object with the period of 200 nm is not observed by confocal microscope but observed by CSICM, because of the CSICM performance with a lateral resolution of 170 nm. It is concluded that CSICM has higher lateral resolution than the confocal microscope. In addition, we reconstruct 3-D profile of standard specimen through several reconstruction processes. Experimental results are regarded as reasonable.
최근에 반도체/FPD 산업, 생의학과 표면 및 재료 과학 등의 다양한 분야에서 고속 고분해능 광학 측정 시스템의 수요가 증가하고 있다. 이러한 수요를 충족시키기 위해서, 공초점 현미경, 이광자 현미경, STED 현미경, 4Pi 공초점 현미경, 구조 조명 현미경 등의 많은 연구들이 진행되고 있다. 하지만 넓은 관찰 영역에서 고분해능 고속 측정 기술에 대한 수요는 여전히 존재한다.
구조 조명 현미경을 이용하여, 일반 광학 현미경의 분해능을 회절 한계 이상으로 향상시키는 연구가 진행되고 있다. 공초점이 아닌, 일반 현미경 구조에 횡방향으로 구조 조명을 해줌으로써, 광손실 없이 회절 한계를 극복할 수 있다. 하지만 총 9 장의 영상을 획득해야 한다. 횡방향 그리고 종방향 분해능을 두 배 향상시키기 위해서는 총 15 장의 영상을 획득해야 한다. 이것 때문에, 영상을 획득하는 속도가 느려지고 영상 복원 과정도 복잡해진다. 따라서, 구조 조명 현미경의 영상 획득 속도를 향상시키는 방법이 주목을 받고 있다. 여러 연구들을 통해서, 구조 조명 현미경의 영상 획득 속도를 향상시키는 노력이 진행되고 있다. 하지만, 아직까지 실제로 실시간 영상 획득 구현은 실현되지 않고 있다.
본 논문에서는 고속 고분해능 십자 구조 조명 공초점 현미경을 제안하고자 한다. 제안하는 십자 구조 조명 공초점 현미경을 통하여, 두 배의 횡방향 분해능 향상, 광절편 기능과 고속 영상 획득을 구현할 수 있다. 십자 구조 조명 공초점 현미경은 십자 구조 조명 현미경과 선 주사 공초점 현미경이 결합된 구조로 이루어져 있다.
십자 구조 조명 패턴은 2차원 회절 격자를 이용하여 생성시킨다. 본 논문에서는, 변조 전달 함수(Modulation Transfer Function, MTF)를 이용하여, 기존의 구조 조명 방법과 제안하는 십자 구조 조명 방법을 정량적으로 비교한다. 그 결과, 십자 구조 조명 방법은 45 도와 135 도 방향을 제외한 나머지 방향에 대해서는 기존의 구조 조명 방법과 유사한 분해능을 나타냄을 알 수 있다. 십자 구조 조명 방법은 회절 격자 또는 시편의 회전이 필요 없기 때문에, 고속으로 구조 조명을 생성시킬 수 있다. 그리고 총 6 장의 영상을 획득하므로, 영상 획득 시간을 줄일 수 있다. 십자 구조 조명 현미경이 구조 조명 현미경과 선 주사 공초점 현미경으로 구성되어 있다는 것을 이론적으로 증명하였다.
고속 고분해능 십자 구조 조명 공초점 현미경의 오차를 분석하였다. 이를 위해, 예측 가능하고 보정 가능한 주요 오차들을 분류하였다. 구조 조명 패턴의 위상을 변화시키기 위해서는, 회절 격자를 기계적으로 움직여 주어야 한다. 정밀 구동을 위해 PZT 구동기를 이용한다. 본 논문에서 사용하는 PZT 구동기의 반복능은 30 nm 이다. 분석 결과, 30 nm의 구동 오차는 십자 구조 조명 공초점 현미경의 영상 복원에 큰 영향을 미치지 않음을 알 수 있다. 두 쌍의 실린더 렌즈와 두 쌍의 선형 편광판을 이용하여, 십자 구조 조명 패턴을 생성시킨다. 두 개의 선 구조 조명 패턴은 서로 수직인 두 개의 선형 편광을 가지고 있다. 두 개의 선 구조 조명 패턴은 간섭이 없고, 서로 독립적이기 때문에, 두 개의 선 구조 조명 패턴은 서로 다른 밝기(intensity)와 가시성(visibility)을 가질 수 있다. 본 논문에서는 밝기/가시성의 차이가 있는 경우와 없는 경우의 두 가지 영상 스펙트럼을 정량적으로 비교하고 분석하였다. 구조 조명 패턴의 밝기 차이는 두 영상의 값을 정규화 시켜줌으로써, 보정할 수 있다. 그리고 구조 조명 패턴의 가시화 차이는 광학계 성능에 큰 영향을 미치지 않기 때문에 무시할 수 있다. 고속 고분해능 십자 구조 조명 공초점 현미경에는 서로 직각을 이루는 두 축을 중심으로 회전하는 두 개의 갈바노 스캐닝 미러를 사용한다. 각각의 갈바노 미러는 시편에서 선 구조 조명 패턴을 스캐닝한다. 그러므로 두 개의 스캐닝 영역 또는 관심 영역(region of interest, ROI)이 다를 수 있다. 두 CCD 카메라에서 획득되는 두 영상이 동일한 영역이 되도록, 광학계 정렬이 매우 중요하다.
제안하는 십자 구조 조명 공초점 현미경의 상세 설계를 수행하였다. 고속 고분해능을 구현하기 위하여, 488 nm 파장을 갖는 레이저를 사용한다. 실시간 영상 획득을 위하여, 영상 획득 속도는 최소 15 frames/s 이상으로 결정하였다. 고분해능을 구현하기 위하여, 100배, NA 0.95의 산업용 대물렌즈를 사용한다. 이론적인 횡방향 분해능은 157 nm, 종방향 분해능은 895 nm 로 계산되었다. 영상의 픽셀 개수는 사용하는 CCD 카메라에 의해 결정되는데, 512 x 512 이다. 경험적으로 볼 때, 목표하는 분해능을 얻기 위해서는, 관찰 영역은 12 μm x 12 μm 이어야 한다. 십자 구조 조명 현미경은 패턴 생성 광학계, 조명 광학계 그리고 검출 광학계로 구성된다. 설계된 십자 구조 조명 현미경은 회절 한계 이하의 RMS 파면 오차 값을 가진다. 스폿 다이어그램(spot diagram)은 Airy disc 안으로 들어오도록 설계되었다. 광학계는 잘 설계되었음을 알 수 있다.
제안한 시스템을 제작하여, 횡방향 및 종방향 분해능 그리고 영상 획득 속도를 측정하여 시스템의 성능을 평가하였다. 횡방향 분해능은 0.172 μm, 종방향은 분해능은 1.02 μm 으로 측정되었다. 이론적인 값보다는 조금 안좋은 결과를 보여주고 있다. 영상 획득 속도는 반사율이 높은 거울 시편에서는 4.8 frames/s, 금 나노 입자에서는 0.77 frames/s를 획득하였다. 그리고150 nm, 200 nm, 250 nm 그리고 500 nm의 다양한 패턴 주기를 갖는 선 패턴 시편을 측정하였다. 공초점 현미경에서는 200 nm 주기를 갖는 선 패턴이 관찰되지 않았지만, 십자 구조 조명 공초점 현미경에서는 관찰되었다. 실험 결과를 통해 십자 구조 조명 공초점 현미경이 일반 공초점 현미경보다 높은 분해능을 가짐을 알 수 있다. 여러 가지 복원 과정을 거쳐서, 3차원 영상 복원 실험도 수행하였고, 적절한 결과를 획득하였다.
본 논문에서 제안하는 십자 구조 조명 공초점 주사 현미경은 횡방향 분해능이 일반 공초점 현미경에 비해 1.36 배 정도 향상되며 공초점 현미경과 유사한 광축 분해능을 갖는다. 파워가 큰 레이저나, 민감도가 높은 CCD 카메라를 사용할 경우, 실시간 영상 획득도 구현 가능하다. 십자 구조 조명 공초점 주사 현미경은 고속 고분해능 영상 획득이 필요한 분야에서 기존의 공초점 주사 현미경을 대체할 수 있을 것으로 기대된다.
