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Structural and functional studies on human BLM and Rad51D related in DNA repair process of homologous recombination = 상동재조합 손상 DNA 복구 과정에 관여하는 BLM 단백질과 Rad51D 단백질의 DNA 상호작용에 관한 NMR 연구
서명 / 저자 Structural and functional studies on human BLM and Rad51D related in DNA repair process of homologous recombination = 상동재조합 손상 DNA 복구 과정에 관여하는 BLM 단백질과 Rad51D 단백질의 DNA 상호작용에 관한 NMR 연구 / Young-Mee Kim.
저자명 Kim, Young-Mee ; 김영미
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2010].
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The HRDC domain, conserved among members of the RecQ helicase family, regulates helicase activity by virtue of variations in its surface residues. The HRDC domain of Bloom syndrome protein (BLM) is known as a critical determinant of the dissolution function of double Holliday junctions by the BLM-TOPOIII$\alpha$ complex. In this study, we determined the solution structure of the human BLM HRDC domain and characterized its DNA binding activity. The BLM HRDC domain consists of five $\alpha$-helices with a hydrophobic $3_{10^-}$ helical loop between helices 1 and 2 and an extended acidic surface comprising residues in helices 3 to 5. The BLM HRDC domain preferentially binds to ssDNA, though with a markedly low binding affinity ($K_d$ ~ 100 $\muM$). NMR chemical shift perturbation studies suggested that the critical DNA binding residues of the BLM HRDC domain are located in the hydrophobic loop and the N-terminus of helix 2. Interestingly, the isolated BLM HRDC domain had quite different DNA binding modes between ssDNA and Holliday junctions in EMSA experiments. Based on its surface charge separation and DNA binding properties, we suggest that the HRDC domain of BLM may be adapted for a unique function among RecQ helicases-that of bridging protein and DNA interactions. The Rad51D and Xrcc2 complex, which belong to the Rad51 paralogs, are required for homologous recombinational repair (HRR) and disruption of Holliday Junction with Bloom syndrome protein (BLM) in vertebrates. The N-terminal domain of Rad51D is essential for protein-protein interaction with Xrcc2 and highly conserved in eukaryotic Rad51D orthologues, but is unknown about its individual structure or function at all. In this study, we determined the solution structure of the human Rad51D N-terminal domain (residues from 1 to 83) and characterized its DNA binding activity. The N-terminal region consists of four- short helices with a long N- and C-terminal tails. However, the N-terminal tail from Met1 to The13 is fixed to helix1by a bridge between Val3 and Thr27. This bridge is driven by two hydrophobic interactions among Leu4-Val28 and Val6-Ile17. We show that the domain preferentially binds to ssDNA than dsDNA by gel electrophetic mobility assays (EMSA). NMR titration and dynamics experiments demonstrated a physical interaction of the domain with ssDNA, and allowed mapping of the DNA binding surface comprising positive and hydrophobic patch. Our results suggest the presence of a DNA binding site on the outside surface of the Rad51D-Xrcc2 filaments and provide a possible explanation for the binding specificity for ssDNA of Rad51D protein.

DNA 이중 나선 손상은 DNA손상 유형에 있어 가장 치명적인 형태이다. 상동재조합 유전자 복구과정은 사람 Rad51 단백질을 중심으로 다섯 가지 Rad51 paralog 단백질들이 참여하여 상동 염색체간에 유전 정보의 교환과 재배열을 통한 손상 유전자 회복법이다. 반면에 과도한 상동재조합은 개체가 가진 고유의 유전정보를 손상시켜 개체의 생존을 위협하고 암을 유발시킨다. Bloom증후군은 BLM유전자 손상에 의해 상동 염색체간에 지나친 유전정보 교환에 의해 염색체가 비정상적인 형태로 변형되어 조기에 신체 전반적인 곳에서 암이 유발하여 사망하는 병이다. BLM 단백질은 TOPOIII$\alpha$ 단백질과 복합체를 이루어 상동재조합 과정에서 생기는 이중 Holliday Junction을 해체하는 기능을 갖는데 이 기능 조절에 있어 C말단 부위의 HRDC도메인의 역할이 매우 중요하다. 따라서 본 연구의 2장에서는 BLM HRDC 도메인의 수용액상 구조와 DNA 결합유무, 또 한가닥 DNA에 특정적으로 결합하는 특성에 대하여 심도 있게 연구하였다. BLM HRDC 도메인의 구조는 기존에 밝혀진 HRDC 유사체들과 매우 비슷한 다섯 개의 나선 이차구조와 그 중 첫번째와 두번째 나선구조 사이에 침수성 성질의고리에 짧은 $3_{10}$ 나선구조가 존재한다. 이 도메인의 표면전하 성질은 기존 유사체들과는 매우 다른 확장된 음전하 성질과 반대 쪽은 침수성 고리를 기반으로 약간의 양전하와 주로 침수성 잔기가 표면에 노출된 특이성을 띤다. 인32 동위원소로 치환된 단일 또는 이중 DNA를 본성을 유지한 폴리아크릴아마이드 젤을 통해 전기영동한 결과 BLM 단백질은 한가닥 DNA에 특정적으로 결합하며, 핵자기공명 분광학을 이용하여 단백질에 농도가 증가하도록 단일 DNA를 적정한 결과 $3_{10}$ 침수성 고리를 통해 주로 DNA와 결합하며 첫번째 나선구조의 C말단, 두번째 나선구조의 N-말단 그리고 세번째와 네번째 나선 상의 고리에 위치한 잔기들이 DNA와 결합함을 알 수 있었다. 단일 아미노산 치환법에 의해 다섯 개의 주요 DNA 결합 잔기들을 알라닌 또는 반대 전하를 가진 전하로 치환하여 잔기간의 결합 중요도를 비교하였다. 그 결과 1237 타이로신 잔기가 단일 DNA 결합에 가장 중요한 역할을 하고 동역학적 핵자기공명 분광 데이터 분석을 통해 이 잔기에 화학적 성질교환이 있음을 확인하였다. 또한 전기영동에서Holliday Junction과 HRDC 도메인의 결합양상이 다르다는 것에 착안하여 본 연구에서는 BLM 단백질이 풍부한 표면 음전하 성질을 이용하여 이중 Holliday Junction간에 전하반발력을 통해 BLM과 TOPOIII$\alpha$ 침범하기 쉽게 만든다는 모델을 세워 BLM 단백질이 과도한 상동재조합 과정을 방해하는 메커니즘을 제시하였다. 본 연구의 3장에서는 Rad51 단백질과 함께 상동재조합법에 의해 DNA 손상을 복구시키는 과정에 필수적인 사람Rad51D 단백질의 N 말단 도메인의 수용액 구조와 DNA 결합력에 대해 연구하였다. 현재까지 구체적인 기능과 구조연구가 전무한 상황에서 본 연구가 가지는 의의는 다섯 가지 Rad51 paralog가 유사성이 떨어지는데 반해 N-말단 부위는 각 ortholog들에서 75% 이상 동일성을 갖는데 착안하여 처음으로 구조연구를 시도한다는데 있다. Rad51D 단백질의 1~83 부분의 구조는 네 개의 나선형태 부분과 N-,C-말단 부위에 유연한 긴꼬리를 가진 형태이다. 그러나 특이하게도 N-말단 고리는 1번과 2번 나선구조에 위치한 침수성 잔기와 4번 루이신 간에 침수성 상호작용이 존재하여 1번나선구조에 고정된 형태를 가진다. 32인 동위원소로 치환된 단일, 이중 그리고 Holliday Junction 중에서 Rad51D N 말단 도메인은 단일 DNA에 선별적으로 결합하였다. 또한 핵자기고명 분광법을 이용한 DNA 적정 실험과 동역학 핵자기공명 분광법에서 R2 값은 1번과 3번 나선구조와 그 사이에 존재하는 양전하 표면 성질과 침수성 잔기들이 DNA 결합에 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다. 본 연구를 통하여 Rad51D 전체 단백질이 가지는 단일 DNA 구조 결합성과 나아가 Rad51D-Xrcc2 결합체에 있어 중요한 결합부위인 Rad51D N 말단 도메인의 역할에 대해 제시하였다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DCH 10030
형태사항 vi, 63 p. : 삽도 ; 26 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 김영미
지도교수의 영문표기 : Byong-Seok Choi
지도교수의 한글표기 : 최병석
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 화학과,
서지주기 References: p. 50-56
주제 Bloom syndrome
HRDC domain
NMR
Structure
protein-DNA interaction
블룸 증후군
HRDC 도메인
핵자기공명
구조
단백질-DNA 상호작용
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