Chinese hamster ovary (CHO) cells have been popular hosts for the commercial production of therapeutic proteins including erythropoietin, antibodies, and antibody-based proteins. For the purpose of higher protein production, numerous omics-based approaches such as genomics, proteomics, transcriptomics, and metabolomics have been tried to understand intracellular events in mammalian cells. Among them, two-dimensional gel electrophoresis (2DE) combined with mass spectrometric (MS) analysis is one of the widely used tools for identifying intracellular factor changes under various culture conditions or interacts with desired therapeutic protein in mammalian cells.
Identification of the cellular proteins interacting with incompletely folded and unfolded forms of erythropoietin (EPO) in recombinant CHO (rCHO) cells leads to better insight into the possible genetic manipulation approaches for increasing EPO production. To do so, a pull-down assay was performed with dual-tagged (N-terminal GST- and C-terminal hexahistidine-tagged) EPO expressed in E. coli as bait proteins and cell lysates of rCHO cells (DG44) as prey proteins. Cellular proteins interacting with dual-tagged EPO were then resolved by 2DE and identified by MALDI-TOF MS/MS. A total of 27 protein spots including glucose regulated protein 78 (GRP78) were successfully identified. 2D-Western blot analysis of GRP78 confirmed the results of the MS analyses. Taken together, a pull-down assay followed by a proteomic approach is found to be an efficient means to identify cellular proteins interacting with foreign protein in rCHO cells.
The glycosylation state in glycoproteins including EPO is important in biosynthesis, secretion, and biological activity. In order to find the intracellular molecules differentially bound with glycosylated or non-glycosylated EPO, fully glycosylated EPO having three N-linked glycosylation sites was purified from EPO-producing rCHO cells by sequential chromatography using heparin column, RP-HPLC column, and gel filtration column. Non-glycosylated EPO was prepared from treating glycosylated EPO with PNGase F which can hydrolyze all types of N-linked glycosylation sites from glycoproteins. Immunoprecipitation was performed with glycosylated or non-glycosylated EPO as bait proteins and cell lysates of rCHO cells (DG44) as prey proteins. Intracellular proteins eluted with non-glycoslated or glycosylated EPO were resolved by 2DE and 21 protein spots differentially bound were selected. Taken together, immunoprecipitation combined with a proteomic technology can be a good strategy to identify new intracellular molecules differentially bound with foreign protein in rCHO cells.
The use of glycine betaine combined with hyperosmolality is known to be an efficient means for achieving high protein production in rCHO cells. However, its effectiveness appears to vary among the individual clones. In order to understand the intracellular events and identify the key factors in rCHO cells cultivated with glycine betaine under hyperosmotic conditions, two-dimensional differential in-gel electrophoresis (2D-DIGE) followed by mass spectrometric analysis was applied. Differentially expressed 19 protein spots were selected and 16 different kinds of proteins were successfully identified because of the multiplicity of protein spots in 2D gel and incomplete database for CHO cells. The addition of glycine betaine under hyperosmotic condition increased the expression level of proteins involved in cellular metabolism (PEPCK, GAPDH, and PK) and cellular architecture ($\beta$-tubulin and $\beta$-actin). The glycine betaine treatment of rCHO cells at the hyperosmolality down-regulated the expression associated with protein folding (GRP78 and OSP94), mRNA processing (Rbm34, ACF, and IPMK), and protein secretion ($\Gamma$-COP). 2D-Western blot analysis of $\beta$-tubulin, GAPDH, Peroxidoxin-1, and GRP78 confirmed the proteomic findings. The proteins identified from this study, which are related to cell growth and antibody production, can be applied to cell engineering for maximizing the efficacy in the use of glycine betaine combined with hyperosmolality in rCHO cells.
Hydrolysates, protein digests hydrolyzed by enzyme or acid, originated from non-animal source are the most feasible source for serum-substituting supplements. Because its effectiveness on cell growth and/or productivity appears to vary depending on their source, mixed form of hydrolysates by statistically designed matrix is more effective than its separate form. In order to understand the intracellular response and identify the key factors in rCHO cells cultivated with optimized hydrolysates mixtures, maximum cell growth rate (Mix $\mu$) and specific antibody productivity Mix $\q_{Ab}$, 2DE combined with nanoLC-ESI-Q-TOF tandem MS was applied. The comparative proteomic analysis showed that 48 differentially expressed spots were detected in cells with Mix $\mu$ and 43 spots in cells supplementing Mix $\q_{Ab}$ were selected as a significant changed spots. The supplementation of Mix $\mu$ up-regulates the expression of metabolism-related proteins, cytoskeleton-associated proteins, and proliferation-related proteins. The expression of anti-proliferative proteins and pro-apoptotic protein is down-regulated by the addition of Mix $\mu$. The supplementation of Mix $\q_{Ab}$ altered the expression of various chaperone proteins and proliferation-linked proteins. 2D-Western blot analysis of differentially expressed proteins confirmed the proteomic results. The identified proteins in this study can provide insights into the effect of hydrolysates on intracellular events and candidates for cell engineering to maximize cell growth and/or protein production in rCHO cells.
재조합 Chinese hamster ovary(CHO)세포는 에리스로포이에틴, 항체, 항체 기반 단백질을 포함하는 치료용 단백질 생산에 있어서 가장 널리 사용되고 있는 숙주세포 중 하나이다. 고농도의 치료용 단백질 생산을 목적으로, 유전체학, 전사체학, 단백질체학, 대사체학과 같은 수많은 오믹스 기반 접근법을 통하여 포유동물 세포주에서 세포 내 현상을 이해하려는 노력들이 시도되고 있다. 포유동물 세포주에서 2차원 전기영동법과 질량 분석법이 결합된 분석법은 다양한 배양 환경에서 변화하는 세포 내부의 주요 인자나 목적 치료용 단백질과 상호작용하는 인자의 발굴에 있어서 널리 사용되고 있는 방법 중 하나이다.
재조합CHO세포에서 폴딩이 제대로 이루어지지 않은 에리스로포이에틴과 상호작용 하는 세포 내 인자의 발굴은 에리스로포이에틴의 생산성 증가를 위한 유전자 조작을 가능케 할 것이다. 이를 위해, 양 말단에 GST 표지와 6개의 히스티딘 표지를 갖는 재조합 에리스로포이에틴을 대장균에서 발현, 정제하고 이를 미끼 단백질로 이용하며, 재조합 CHO 세포(DG44)의 파쇄액은 먹이 단백질로 이용했다. 두 개의 표지를 갖는 재조합 에리스로 포이에틴과 상호작용하는 세포 내 단백질은 2차원 전기영동법을 통하여 분석하며 MALDI-TOF-MS/MS를 이용하여 확인했다. GRP78을 포함하는 총 27개의 단백질 스팟 을 성공적으로 확인했다. GRP78에 대한 2차원 웨스턴 블롯을 통하여 질량 분석법의 결과를 재확인했다. 결론적으로, 단백질체학과 결합된 GST결합 활성법은 재조합 CHO 세포에서 외래단백질과 상호작용하는 세포 단백질의 발굴에 유용한 방법임을 확인했다.
에리스로포이에틴을 포함하는 당단백질의 당화 정도는 단백질의 생합성, 분비, 생물 학적 활성도에 있어서 중요하다. 세포 내에서 비당화 에리스로포이에틴이나 당화 에리스로 포이에틴과 차별적으로 결합하는 물질을 찾기 위해, 헤파린 컬럼, RP-HPLC 컬럼, 겔여과 컬럼을 이용한 순차적 크로마토그래피를 통하여 3개의 N 연결 당화점에 당을 포함하는 완전 당화 에리스로포이에틴을 순수 분리 정제했다. 비당화 에리스로포이에틴은 당화 에리 스로포이에틴에 PNGase F 효소를 처리하여 3개의 N 연결 당화점의 당을 제거함으로써 얻었다. 비당화 에리스로포이에틴이나 당화 에리스로-포이에틴을 미끼 단백질로 이용했고, 재조합 CHO 세포(DG44)의 파쇄액은 먹이 단백질로 이용하여 면역침강법을 수행했다. 비당화 에리스로포이에틴이나 당화 에리스로포이에틴에 차별적으로 결합하는 세포 내 단백질은 2차원 전기영동법을 통하여 분석했으며 그 결과 21개의 단백질 스팟을 확인했다. 결론적으로, 단백질체학과 결합된 면역침강법은 재조합 CHO세포에서 외래단백질과 차별적으로 상호작용하는 신규 단백질 분석에 좋은 전략이 될 수 있음을 확인했다.
고삼투압과 결합된 glycine betaine (이하 GB라 명명)의 첨가는 재조합 CHO세포에서 치료용 단백질의 고생산성을 얻기 위한 좋은 접근법 중 하나이다. 그러나, 그 효과는 개별 세포주에 따라 다양하다. 고삼투압 조건하에서 GB를 첨가하여 배양한 재조합 CHO세포의 내부 현상을 이해하고 주요 인자의 변화를 확인하기 위해, 2차원 차등 겔 전기영동에 이은 질량 분석법을 적용했다. 차별적으로 발현되는 19개의 단백질 스팟을 선택했고 이 중 16개의 단백질을 성공적으로 분석했다. 이런 제한적 분석은 2차원 전기영동 겔에서 존재하는 단백질 스팟의 다위치성과 CHO세포의 불완전한 유전정보에 기인한다. 고삼투압 조건하에서 GB첨가는 세포 대사(PEPCK, GAPDH, PK)나 세포구조($\beta$-tubulin, $\beta$-actin)와 연관된 단백질의 발현량을 증가시켰다. 반면에, 고삼투압 조건에서 GB처리는 단백질 폴딩(GRP78, OSP94), mRNA 프로세싱(Rbm34, ACF, IPMK), 단백질 분비($\Gamma$-COP)와 관련된 단백질의 발현량을 감소시켰다. $\beta$-tubulin, GAPDH, Peroxidoxin-1, GRP78에 대한 2차원 웨스턴 블롯을 통하여 질량 분석법의 결과를 재확인했다. 결론적으로, 본 연구를 통해 발굴된 단백질 중 세포 성장과 항체 생산성에 관련된 단백질은 재조합 CHO세포에서 고삼투압과 GB의 이용시 그 효능을 최대화하기 위한 세포공학 기술의 후보물질로써 적용이 가능할 것이다.
비동물유래 가수분해단백질(hydrolysates)은 혈청 대체 물질로써 가장 널리 쓰이는 자원 중 하나이다. 가수분해단백질이 세포 성장과 단백질 생산성에 미치는 영향은 사용되는 가수분해단백질 종류에 따라 다양하기 때문에, 개별적으로 사용하는 것보다는 통계학적 접근법을 이용하여 하나 이상의 가수분해단백질의 복합체로 사용하는 것이 효율적이다. 최적화된 가수분해 단백질의 복합체, 즉 최고의 세포 성장을 보이는 조건(Mix $\mu$)와 최고의 항체 생산성을 보이는 조건(Mix $\q_{Ab}$)의 복합체를 첨가한 무혈청배지에서 배양된 재조합 CHO세포의 내부 변화를 이해하고 이와 관련된 주요 인자를 발굴하기 위해 2차원 전기 영동법을 수행했으며 nanoLC-ESI-Q-TOF tandem MS를 이용하여 확인했다. 비교 단백질체 분석학을 통하여, Mix $\mu$가 첨가한 조건에서 48개의 차별적인 발현을 보이는 단백질 스팟을 확인했고 Mix $\q_{Ab}$가 첨가한 조건에서 43개의 단백질 스팟을 확인했다. Mix $\mu$의 첨가는 대사관련단백질, 세포골격관련단백질, 세포증식관련단백질의 발현량을 증가시켰다. 항-세포증식 관련단백질과 세포예정사관련단백질의 발현량은 Mix $\mu$의 첨가에 의해 감소 했다. Mix $\q_{Ab}$의 첨가는 다양한 샤페론 단백질과 세포증식관련단백질의 발현량에 영향을 미쳤다. 차별적으로 발현되는 것으로 분석된 단백질에 대한 2차원 웨스턴 블롯을 통하여 질량 분석법의 결과를 재확인했다. 결론적으로, 본 연구에서 발굴된 단백질은 가수 분해단백질이 세포 내부 변화에 미치는 영향에 대한 이해를 높였으며 재조합 CHO세포에서 가수분해단백질의 이용성을 극대화하기 위한 세포공학기술을 위한 후보 물질을 제공했다.
