The importance of sialic acids, which are occupied the terminal sites of $\It{N}$-linked glycans in glycoproteins, is well known from many researches. The galactose-exposed glycoproteins are cleared rapidly from blood streams by capturing asialoglycoprotein receptors in hepatocytes. Therefore we explored to maximize the sialylation of human erythropoietin by genetic engineering of sialylation pathway in CHO cells.
Sialylation is catalyzed by the various sialyltransferases using CMP-sialic acid as an active sugar donor in lumen of the Golgi apparatus. Thus, the activity of sialyltransferase is the key factor to determine the sialylation level of glycoproteins. In this study, we compared the effect of various sialyltransferase overexpression in rhEPO-producing CHO cells. Different from the human cells, Chinese hamster cells lack the genes encoding $\alpha$2,6-sialyltransferase ($\alpha$2,6-ST). Thus, human $\alpha$2,6-ST was overexpressed in CHO cells to produce the much human-like glycoproteins. Chinese hamster $\alpha$2,3-ST was overexpressed to demonstrate the necessity of signal peptide for the localization of sialyltransferase. The sialic acid content of rhEPO which produced from Chinese hamster $\alpha$2,3-ST overexpressed CHO cells showed the similar increment as compared that of human $\alpha$2,3-ST overexpressed CHO cell lines. The sialic acid contents of rhEPO was most significantly increased when the human $\alpha$2,3-ST and human $\alpha$2,6-ST was overexpressed simultaneously up to 20.4%. The sialic acid content of rhEPO produced from EC2-1H9-H26ST 8 cell lines was increased up to 13.0%. The overexpression of human $\alpha$2,6-ST in CHO cells typically showed the much higher increment of sialic acid contents in produced rhEPO. However, there were various reports about the effect of $\alpha$2,6-linked sialic acid in pharmacokinetics of therapeutic glycoproteins. Thus, the accurate effects and functions of $\alpha$2,6-linked sialylation have to be determined to apply these results in the industrial production of therapeutic glycoproteins.
CMP-sialic acid is the active substrate of sialyltransferase, which is synthesized in the cytosol and nucleus followed the several steps of enzymatic reactions. Thus, the depletion of CMP-sialic acid in Golgi apparatus is the limiting factor of complete sialylation of glycoproteins. GNE (UDP-GlcNAc 2-epimerase)/MNK (ManNAc kinase) is a bifunctional enzyme which is acted on the initial two steps of sialic acid biosynthesis, and is regulated by CMP-sialic acid in feedback manner. Sialuria is a rare congenital disorder which destroyed the feedback inhibition by the point-mutation in allosteric site of GNE. From $\It{in vitro}$ assays of various sialuria-mutated rat GNE activities, rat GNE/MNK-R263L-R266Q mutant was shown 93.6% relative activity compared to wild-type, and the feedback inhibition was not detected. This sialuria-mutated rat GNE/MNK was introduced to the recombinant human EPO (rhEPO) producing Chinese hamster ovary (CHO) cells. The intracellular CMP-sialic acid pools of rat GNE/MNK-R263L-R266Q overexpressed CHO cells were markedly increased up to 10.5 folds compared to control, and the sialic acid contents of rhEPO were enhanced up to 8.3% as compared to control. We found the powerful sialuria-mutated rat GNE/MNK (R263L-R266Q mutant) to increase the intracellular CMP-sialic acid pools by genetic engineering. The sialylation of recombinant human EPO was slightly enhanced by the increment of intracellular CMP-sialic acid in rat GNE/MNK-R263L-R266Q overexpressed CHO cells.
From the previous research, the concentration of intracellular CMP-sialic acid was significantly increased as high as the supplementation of ManNAc in culture medium by the overexpression of rat GNE/MNK-R263L-R266Q. However, the sialylation of rhEPO was not remarkably increased in this approach. Thus, Sialuria-mutated rat GNE/MNK, Chinese hamster CMP-SAT, and human $\alpha$2,3-ST were transfected simultaneously into the rhEPO-producing CHO cells to improve the sialylation pathway. The effect of sialuria-mutated GNE/MNK expression was verified by the analysis of intracellular CMP-sialic acid that was increased up to 10.7 folds compared to control. Furthermore, the sialic acid contents were significantly increased up to 43%. The asialo- and mono-sialylated N-glycans were decreased by half compared to control, whereas the tetra-sialylated $\It{N}$-glycans were increased up to 32.0%. In this study, the effective CHO cell lines were constructed to produce the more sialylated therapeutic glycoproteins by overexpression of sialuria-mutated rat GNE/MNK, Chinese hamster CMP-SAT, and human $\alpha$2,3-ST.
당단백질에서 $\It{N}$-결합 당쇄의 말단에 존재하는 시알산 잔기의 중요성은 많은 연구를 통해 잘 알려져있다. 그 중에서도 시알산 잔기 없이 갈락토오즈가 노출된 당단백질은 간세포의 asialoglycoprotein 수용기에 의해 혈관에서 빠르게 제거되기 때문에 치료용 당단백질의 체내 반감기에 결정적인 역할을 한다. 따라서, 우리는 CHO 세포에서 생산되는 재조합 인간 에리스로포이에틴의 시알산 함량을 증가시키기 위하여 유전 공학적인 방법을 사용하여 시알산 대사 과정을 향상시켰다.
시알산화는 골지체에서 CMP-시알산을 활성 전구체로 사용하여 다양한 시알산 전이효소에 의해 진행된다. 따라서, 시알산 전이효소의 활성은 당단백질의 시알산화를 결정하는 중요한 요소가 된다. 본 연구에서는 다양한 시알산 전이효소를 재조합 인간 에리스로포이에틴을 생산하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 과발현하여 그 효과를 비교해보고자 하였다. 인간 세포와는 달리, 중국 햄스터 세포의 경우 $\alpha$2,6-시알산 전이 효소의 유전자가 결여되어 $\alpha$2,6-결합의 시알산이 존재하지 않는다. 따라서, 인간 $\alpha$2,6-시알산 전이 효소를 도입하여 보다 인간 유래의 당단백질과 유사한 당쇄 구조를 갖도록 하였다. 시알산 전이효소의 세포 내 특정 위치에 발현되기 위하여 신호 펩타이드가 필수적인가를 확인하기 위하여 중국 햄스터 세포 자체의 $\alpha$2,3-시알산 전이효소를 과발현하였다. 중국 햄스터 $\alpha$2,3-시알산 전이효소를 과발현한 CHO 세포주에서 생산된 에리스로포이에틴의 시알산 함량은 인간 $\alpha$2,3-시알산 전이효소를 과발현한 경우와 유사하게 증가되는 것을 확인하였다. 인간 $\alpha$2,3-시알산 전이효소와 인간 $\alpha$2,6-시알산 전이효소를 동시에 과발현한 CHO 세포주에서 생산된 에리스로포이에틴의 시알산 함량이 20.4%로 가장 크게 증가되었고, 인간 $\alpha$2,6-시알산 전이효소만을 과발현 한 세포주인 EC2-1H9-HST 8 세포주의 경우 13.0% 에리스로포이에틴의 시알산 함량이 증가되었다. CHO 세포에서 일반적으로 인간 $\alpha$2,6-시알산 전이효소를 과발현 한 경우 생산 되는 에리스로포이에틴의 시알산 함량이 더 크게 증가 되었다. 그러나 치료용 당단백질에서 $\alpha$2,6-결합의 시알산이 약리활성에 미치는 영향에 대하여 다양한 보고가 있어왔다. 따라서, 이러한 결과를 산업적인 치료용 당단백질 생산에 활용하기 위해서는 $\alpha$2,6-시알산화의 정확한 효과에 대한 연구가 먼저 이루어져야 한다.
CMP-시알산은 골지체에서 시알산 전이효소의 활성 전구체로 사용되며, 몇 단계의 효소 작용에 의해 세포질과 세포핵을 거치면서 합성된다. 따라서, 골지체 내에서 전구체인 CMP-시알산의 부족은 당단백질의 완벽한 시알산화를 저해하는 요소 중 하나이다. UDP-GlcNAc 2-에피머라제/ManNAc 카이네이즈는 시알산 생합성의 초반 두 단계를 촉매하는 효소로서, 이 중 에피머라제의 기능은 CMP-시알산의 피드백 저해를 받는다. Sialuria는 드물게 나타나는 선천적인 유전 질환으로서 GNE 유전자의 알로스테릭 위치에 점 돌연변이로 인하여 이러한 피드백 저해가 파괴되어 나타난다. 다양한 sialuria 변이를 도입한 쥐의 GNE 효소의 활성 측정을 통하여, R263L-R266Q 변이가 도입된 GNE 효소에서 천연형의 93.6%의 활성을 유지하면서 피드백 저해는 받지 않는 것을 확인하였다. 이와 같은 sialuria 변이가 도입된 쥐의 GNE/MNK를 재조합 인간 에리스로포이에틴을 생산하는 CHO 세포인 EC2-1H9에 도입하였다. Rat GNE/MNK-R263L-R266Q를 과발현한 CHO 세포의 세포내 CMP-시알산의 양은 대조군 세포에 비해 10.5배 이상 크게 증가하였지만, 에리스로포이에틴의 시알산 함량은 8.3% 정도 증가하였다. 본 연구를 통해 유전 공학을 사용하여 세포내의 CMP-시알산의 양을 크게 증가시킬 수 있는 강력한 sialuria 변이가 도입된 쥐의 GNE/MNK를 확보하였다. 또한, 유전 공학에 의해 증가된 세포내의 CMP-시알산에 의해 치료용 당단백질의 시알산화를 약간 증가시켰다.
앞선 연구에서 rat GNE/MNK-R263L-R266Q을 과발현하여 기존의 배지에 ManNAc을 첨가하는 방법과 유사한 수준으로 세포내의 CMP-시알산을 크게 증가시킬 수 있었다. 그러나 에리스로포이에틴의 시알산화는 이러한 CMP-시알산의 증가에 비해 크게 증가되지 않았다. 따라서, 인간 에리스로포이에틴을 생산하는CHO 세포에서 시알산 대사 경로를 강화하기 위하여 시알산 변이가 도입된 rat GNE/MNK, 중국 햄스터 CMP-시알산 전달단백질 (transporter, CMP-SAT)과 인간 $\alpha$2,3-시알산 전이효소 ($\alpha$2,3-ST)를 동시에 도입하였다. Sialuria 변이가 도입된 GNE/MNK의 과발현에 의해 세포내의 CMP-시알산의 양은 10.7배 증가되었다. 또한, 시알산 대사 경로의 강화로 인하여 시알산 함량은 대조군에 비해 43% 정도 크게 증가되었고, IEF에서도 시알산 잔기의 증가로 인하여 isoform이 음전하 쪽으로 전체적으로 이동하는 것을 확인하였다. 시알산이 붙지 않거나 시알산이 한 개 붙어 있는 $\It{N}$-결합 당쇄의 비율은 절반 이하로 감소하였고, 반면 네개의 시알산 잔기를 모두 갖는 $\It{N}$-결합 당쇄의 비율은 32%까지 증가하였다. 따라서, rat GNE/MNK-R263L-R266Q, 중국 햄스터 CMP-시알산 전달효소와 인간 $\alpha$2,3-시알산 전이효소의 동시 과발현을 통하여 세포 내 CMP-시알산 전구체의 양을 크게 증가시키고, 동시에 시알산 대사 경로를 강화하여 보다 높은 시알산 함량을 갖는 치료용 당단백질 생산을 위한 효과적인 CHO 세포주를 구축하였다.
