In this dissertation, I analyzed the characteristics of protein with the fluorescence spectroscopic methods such as the time-domain lifetime measurements and the fluorescence correlation spectroscopy (FCS) using the confocal microscope based on the time-correlated single photon counting (TCSPC). At first, I applied the FCS to the molecules in ultra-low concentration and simulated a statistical model of FCS based on a Poisson process. The statistical model confirmed that the relative mean square amplitude of the fluctuations is shown to be inversely proportional to the average number of molecules, when the signal-to-noise ratio and measurement time are carefully controlled. Next, the lifetime characteristics of the enhanced cyan fluorescence protein (ECFP) were investigated. The ECFP lifetimes can be changed in relation to the pH value and integration times. The protonation is the main cause of the pH dependence of ECFP lifetime. The average lifetime variations according to the relatively short integration time can be overcome by the acquisition of the sufficient photon counts. However, there can be trade-off between the accuracy of the lifetime estimation and the information loss. Lastly, the conformational change of the maltose binding protein (MBP) was investigated by the fluorescence decay time method. The ECFP and the enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) were fused to the MBP as a donor and an acceptor, respectively. The donor lifetime decreases when MBP undergoes conformational change, leading to closure of the two domains where the ECFP and the EYFP were fused. The donor lifetime shortening showed dependence on the maltose concentration. The auto correlation amplitude and the brightness were suggested as another indicator for the detection of FRET.
본 연구에서는 형광 물질의 감쇄시간과 상관 함수에 기초한 형광분광법을 이용하여 단백질의 특성을 연구 하였다. 시간-상관 단광자 계수 방법은 감쇄시간을 측정하는 방법의 하나로서, 시간 영역에서 시간-분해능 특성을 갖는 데이터를 얻을 수 있으며 형광 물질의 감쇄시간을 구하기 위해서는 일정한 시간의 관측시간을 통하여 히스토그램을 구하고 커브 피팅 방법을 이용하여 감쇄시간을 추출할 수 있다. 본 연구를 위하여 시간-상관 단광자 계수 방법에 기초한 공초점 현미경을 구성하였다. 형광 상관 분광법은 낮은 농도에서의 형광 물질의 동역학을 알 수 있는 방법이다. 먼저, 형광 상관 분광법을 이용하여 극히 낮은 농도의 형광 구슬에서도 G(0) 값이 형광 물질의 개수에 반비례 하는 특성을 보이는지 살펴보았다. 포아손 분포를 이용한 통계적 모형을 이용하여, 일정한 신호 대 잡음 비와 관측 시간이 보장되면, 극히 낮은 농도에서도 형광 신호 변동 값의 제곱 평균치가 형광 물질 개수의 평균치에 반비례 함을 확인하였다. 두 번째로, 청색 형광 단백질의 감쇄수명 특성을 연구 하였다. 감쇄수명을 추출하기 위해서는 일정한 적분구간이 필요한데, 이 적분구간이 짧으면 빠르게 변화하는 형광 물질의 동역학에 대한 정보를 포함할 수 있는 반면, 추출된 평균 감쇄수명의 분산 값이 커지게 된다. 정밀한 감쇄수명을 구하기 위해서는 일정한 개수 이상의 광자확보가 중요한 요소임을 밝혔다. 마지막으로, 맥아당 결합 단백질이 맥아당과 결합하게 되면 구조적인 변화를 일으키는 현상을 감쇄시간의 측면에서 연구하였다. 맥아당 결합 단백질에 청색 형광 단백질과 황색 형광 단백질을 유전적으로 결합시켜서 맥아당에 의한 구조적 변화가 생길 때, 각각 에너지의 공여자와 수여자로서 기능을 하며, 접힘 구조가 되어 공여자와 수여자 사이의 거리가 일정거리 이하에 놓이게 되면, 공여자의 감쇄수명이 줄어든다. 또한, 공여자의 감쇄수명은 맥아당의 농도에 비례함을 보였다. 형광 공명 에너지 전송의 검출은 빛 강도에 의한 방법, 감쇄수명에 의한 방법 이외에도 상관 관계를 이용해서도 할 수 있음을 보였다.