Small interfering RNA (siRNA) of about 22 nucleotides in length can degrade mRNA that shares a homologous sequence with the siRNA by the mechanism called RNA interference (RNAi), resulting in the highly specific inhibition of gene expression. Because of its high specificity and high efficiency, siRNA technology began to be widely used in biomedical research and in the development of innovative medicines. Especially, it is the one of the most attractive technologies for gene therapy of many diseases such as cancers and genetic diseases. The clinical potential of ‘Naked’ siRNA, however, is limited by the poor pharmacokinetic profiles, resulting from the susceptibility of RNA molecules to serum nuclease, renal clearance and non-specific biodistribution. Also, naked siRNA is too negatively charged to cross cellular membranes. The advanced delivery systems of siRNA, therefore, have been required.
In chapter 1, branched polyethylenimine (bPEI) (Mw= 25 k) conjugated with catechol groups (PEI-C) was crosslinked to produce PEI nanogels (PCNs), which were used as a new class of small interfering RNA (siRNA) delivery carrier. The conjugated catechol groups were crosslinked with primary amines of PEI under basic conditions. The size and morphology of PCNs were analyzed by dynamic light scattering (DLS) and atomic force microscopy (AFM). The resultant PCNs were very stable and had an average diameter of $111.4 \plusmn 14.8 nm$ in aqueous solution. Compared with bPEI, PCNs exhibited far reduced cytotoxicity, and formed more stable complexes with siRNA. The PCNs/siRNA complexes exhibited enhanced cellular uptake and promoted gene silencing efficiency, suggesting that they can be potentially used as a less cytotoxic siRNA carrier.
In chapter 2, thermo-responsive quantum dots (Thermo-QDs) that exhibit an “on-demand” cellular uptake behavior via selective “shielding/deshielding” of cell penetrating peptides (CPP) on the surface were fabricated. Poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) (Mw= 11.5 k) and CPP were biotinylated at their terminal ends and co-immobilized onto the surface of streptavidin-coated quantum dots (QDs-Strep) through biotin-streptavidin interaction. Thermo-QDs exhibited far enhanced cellular uptake above lower critical solution temperature (LCST), compared to that below the LCST, proving that grafted PNIPAAm chains on the surface of QDs were collapsed with concomitantly exposing CPP moieties for facile cell recognition. The thermo-responsive “shielding/deshielding” of CPP were further applied for a thermally triggered siRNA delivery system, where biotinylated siRNA was additionally conjugated to the surface of Thermo-QDs. The level of gene silencing was more pronounced with increasing temperature above the LCST, due to the surface exposure of CPP.
siRNA는 약 22개의 핵산으로 이루어진 이중나선의 RNA이다. 이들은 RNAi라고 불리는 일련의 과정을 통하여 상보적 mRNA를 자르고, 그에 따라 매우 특이적인 유전자 발현 억제를 가능하게 한다. 이들의 특이적인 유전자 발현 억제는 매우 효율성이 높기 때문에 siRNA 기술은 생명의학 연구에서 매우 널리 사용되기 시작하였다. 하지만 siRNA 그 자체로는 효율적인 세포 내로의 전달이 힘들기 때문에, 새로운 siRNA 전달체가 개발될 필요성이 있다.
1단원에서는 폴리에틸렌이민(bPEI) 에 카테콜 그룹을 도입한뒤, 그것을 가교시켜 새로운 siRNA 전달체로 사용이 가능한 PEI 나노젤을 합성하였다. PEI 나노젤의 크기와 모양은 DLS와 AFM을 통하여 측정하였을 때 $111.4 \plusmn 14.8 nm$ 였으며, 둥근 모양을 가지고 있었다. 또한 비교군으로 이용된 bPEI보다 세포독성이 매우 줄어들었으며, siRNA와 더욱 안정적인 복합체를 형성한다는 것을 확인하였다. PEI 나노젤의 세포 유입량은 bPEI보다 높았고, 그에 따라 siRNA와의 복합체 형성을 통한 유전자 발현 억제 효율도 높아졌다. 따라서 본 단원에서 소개된 PEI 나노젤은 세포독성이 적으며, 유전자 발현 억제 효율도 좋은 siRNA 전달체로써 사용이 가능 함을 알 수 있었다.
2단원에서는 세포관통단백질과 온도민감성 고분자인 폴리나이팜(Mw= 11.5 k) 을 양자점에 붙여서, 온도 특이적 세포 유입을 보이는 온도민감성 양자점을 제조하였다. 본 연구에서 제조한 온도민감성 양자점은 폴리나이팜의 LCST(~$32\degC$)보다 낮은 온도에서는 폴리나이팜이 매우 친수성의 성질을 띠기 때문에 펼쳐진 상태가 되고, 그에 따라 세포관통단백질이 세포막을 인지하는 것을 방해하여 세포 내로의 유입이 줄어 들었다. 하지만 LCST이상의 온도에서는 폴리나이팜이 매우 소수성의 성질을 띠기 때문에 양자점의 표면에 붙어있게 되고, 그에 따라 세포관통단백질이 세포막을 인지하는 것이 수월하게 되어 세포 내로의 유입이 증가 하였다. 이처럼 온도에 따른 세포 내 유입량 조절이 가능한 양자점에 siRNA를 붙여 온도에 따른 siRNA의 유입량의 변화를 통한 온도 특이적 유전자 발현 억제를 관찰하였고, 그에 따라 siRNA 유입량을 온도민감성 양자점을 통해 조절하여 온도 특이적 유전자 발현 억제가 가능함을 확인하였다.
