Glycosylation is one of important post-translational modifications in eukaryotic cells. The glycan structures of glycolprotein can affect the enzyme activity, antigenicity, stability, pharmacokinetics, protein secretion and in vivo clearance rate. Glycosylation has been classified mainly the N-glycosylation and O-glycosylation linked to a specific peptide sequence. Terminal sites of glycan are often covered by sialic acid that can be linked maximum 4 in N-linked glycan, 2 in O-linked glycan.
The sialic acid of N-glycan terminal site is the most important factor that affects in vivo half-life of many glycoproteins. The asialoglycoprotein receptors in liver can capture the exposed galactose residues of glycoproteins in blood stream. Thus, the in vivo half life of many glycoproteins can be significantly increased by the improvement of sialic acid contents.
The sialylation of glycoproteins will be increased by maximizing the intracellular CMP-sialic acid pool. However, the increased CMP-sialic acid concentration can inhibit the epimerase activity of UDP-GlcNAc 2-epimerase/ManNAc kinase which is incorporated in the biosynthesis of CMP-sialic acid by negative feedback. Sialuria is a rare inborn error which has been mutated within the allosteric site of epimerase gene (R263L, R266Q and R266W). This muatated GNE/MNK lacks the feedback inhibition of CMP-sialic acid causing the excessive synthesis of sialic acid. In this study, we try to introduce the sialuria-like mutated GNE/MNK gene into CHO cells which produce recombinant human erythropoietin (rhEPO) to increase the intracellular CMP-sialic acid pool.
Prior to introducing the mutated GNE/MNK gene to CHO cells, we introduced the one or two amino acid substituted rat GNE/MNK gene to E.coli cells to perform the activity test. When 150uM CMP-NeuNAc was added, activity of wild type GNE/MNK was significantly decreased. When concentration of CMP-NeuNAc was 150uM, activity of wild type GNE/MNK was decreased to 13%. Whereas, sialuria like mutated GNE/MNK maintained uniform activity irrespective of CMP-NeuNAc concentration. Absolute activity of one amino acid substituted GNE/MNK (R263L) was 62.30% comparing to activity of wild type GNE/MNK. And two amino acids mutated GNE/MNK (R263L, R266Q) presented similar activity (93.59%) comparing to wild type GNE/MNK.
Two kinds of sialuria-like mutated GNE/MNK genes, activity was confirmed, were introduced to CHO cells. After constructing the stable cell line, cultured these cells. And then, we extracted the intracellular CMP-sialic acid to measure the concentration of CMP-sialic acid. Amount of CMP-sialic acid of CHO cells containing one amino acid substituted GNE/MNK gene was increased 186% comparing to control CHO cells. CHO cells introducing two amino acids mutated GNE/MNK gene showed 1170% increased CMP-sialic acid compared with control CHO cells.
Also, we measured the sialic acids of EPO produced from stable cell lines. Sialic acids were not increased comparing to wild type. We concluded that enhancing sialylation of EPO requires not only cytosolic CMP-sialic acid which is precursor of sialic acid but also co-introducing other genes which is related to sialylation pathway.
당화(glycosylation)는 진핵 세포에서 일어나는 번역 후 변형 과정(post-translational modification)에 있어서 가장 중요한 부분을 차지하고 있다. 당단백질의 당 구조는 당단백질의 특성에 많은 영향을 미치며 그 특성들에는 효소 활성, 면역성, 안정성, 약물 동태학, 단백질 분비, 체내 제거율 등이 있다. 당화는 크게 N-linked 당화와 O-linked 당화로 구분할 수 있고, 특정 폴리펩티드 위치에 당이 결합됨으로써 당화가 일어나게 된다. 당쇄 끝에는 시알산이 결합하게 되고, N-linked 당화의 경우 최대 4개, O-linked 당화의 경우 최대 2개의 시알산이 결합할 수 있다.
N-linked glycan 의 시알산은 주로 당 단백질의 체내 제거율에 관여한다. 시알산이 결합되지 않은 당쇄는 간의 asialyglycoprotein receptor 에 의해 제거되나, 시알산이 결합되어 있는 당쇄는 이 receptor에 결합되지 않아 체내에서 오랫동안 유지된다. 따라서 당 단백질의 시알산을 증진시킴으로써 해당 당 단백질의 체내 반감기를 증가 시킬 수 있다.
CMP-NeuNAc 는 시알산의 전구체로서 세포 내 CMP-NeuNAc pool 을 증진시킬 경우, 당 단백질의 시알산 증가를 기대할 수 있다. 그러나 세포 내 CMP-NeuNAc가 증가하면 음성되먹임억제(negative feedback inhibition) 작용으로 CMP-NeuNAc의 생합성 과정에 관여하는 UDP-GlcNAc 2-epimerase/ManNAc kinase(GNE/MNK) 유전자의 epimerase 기능을 저해한다. Sialulria 라는 질병은 이러한 알로스테릭 저해 위치에 변이가 발생하여 CMP-NeuNAc 의 농도가 증가함에 따라 epimerase 의 활성이 저해 되지 않는다. 따라서 이러한 점 돌연변이를 포함한 GNE/MNK 유전자를 재조합 EPO 생산 CHO 세포에 도입하여 CHO 세포 내 CMP-NeuNAc pool 을 늘리고자 하였다.
CHO 세포에 도입하기 전 rat GNE/MNK 유전자의 263번 아미노산 하나 또는 263번과 266번아미노산 두 개를 치환시켜 E.coli 에 도입하여 활성 저하를 측정하였다. Wild type GNE/MNK효소는 CMP-NeuNAc 양이 증가할수록 그 활성이 감소하여 CMP-NeuNAc 150mM의 농도에서는 활성이 수준으로 감소하였다. 반면 변이된 GNE/MNK 의 경우 CMP-NeuNAc 농도에 상관없이 일정한 활성을 유지하였다. 또한, 263번 아미노산 하나만 치환된 경우 wild type에 비해 활성 절대값이 62.30% 인데 반해, 263번과 266번 아미노산 두 개가 치환된 GNE/MNK 는 wild type과 유사한 수준의 활성값을 보였다.
활성을 확인한 변이된 GNE/MNK 유전자 두 가지를 인간 재조합 EPO 생산 CHO 세포에 각각 도입시켰다. Stable 세포주를 구축하고 이들 세포를 배양하여 세포 내 CMP-NeuNAc 를 추출해내어 그 농도를 측정하였다. 263번 아미노산 하나만 치환된 GNE/MNK 를 도입시킨 CHO 세포는 wild type CHO 세포에 비해 CMP-NeuNAc 의 양이 약 186% 증가하였으며, 263번과 266번 아미노산 두 개가 치환된 GNE/MNK 를 도입시킨 CHO 세포는 wild type 대비 약 1170%가 증가함을 확인하였다.
구축한 세포주들로부터 EPO 를 생산하여, EPO 의 시알산을 측정하였다. Wild type 의 CHO 세포와 비교하여 시알산이 증가하지 않음을 확인하였다. 이를 통해 EPO의 시알산 증가를 위해서는 전구체인 CMP-NeuNAc 의 증가뿐만 아니라, 세포 내 CMP-NeuNAc 가 시알산으로 변형되고 이용되기 위해 필요한 CMP-NeuNAc transporter 와 sialyltransferase 등의 여러 유전자의 동시 도입이 요구된다.
