Now that many genomes have been sequenced and the products of newly identified genes have been annotated, the next goal is to engineer the desired phenotypes in organisms of interest. For the phenotypic engineering of microorganisms, we have developed novel artificial transcription factors (ATFs) capable of reprogramming innate gene expression circuits in Escherichia coli. These ATFs are composed of zinc finger (ZF) DNA-binding proteins, with distinct specificities, fused to an $\It{E. coli}$ cyclic AMP receptor protein (CRP). By randomly assembling 40 different types of ZFs, we have constructed more than $6.4\times10^4$ ATFs that consist of 3 ZF DNA-binding domains and a CRP effector domain. Using these ATFs, we induced various phenotypic changes in $\It{E. coli}$ and selected for industrially important traits, such as resistance to heat shock, osmotic pressure, and cold shock. The genes of $\It{E. coli}$ that are associated with the thermotolerance were then identified and characterized. We have also observed that our ATF can generate various levels of phenotypic improvements, such as the different degree of thermotolerance, when they were expressed at various levels with different expression vectors.
In addition, with these ATFs, we selected a butanol-tolerant $\It{E. coli}$ which can tolerate up to 1.5% (vol/vol) butanol, ith a concomitant increase in heat resistance, and then engineered a butanol production pathway into the selected butanol-tolerant $\It{E. coli}$. This engineered butanol-tolerant $\It{E. coli}$ shows an $\sim 13%$ increase in butanol production compared to the wild-type $\It{E. coli}$.
Furthermore, we showed the application of these ATFs to the butanol-producing $\It{Clostridium acetobutylicum}$ for improved butanol tolerance and selected a butanol-tolerant $\It{C. acetobutylicum}$, which shows an $\sim 110%$ increase in butanol production compared to the wild-type $\It{C. acetobutylicum}$. These results and the general applicability of this platform clearly indicate that novel ATFs are powerful tools for the phenotypic engineering of microorganisms and can facilitate strain improvement for industrial applications and microbial functional genomic studies.
방대한 양의 유전체 정보가 축적된 포스트 게놈 시대의 도래 이후, 생명체의 특정 phenotype을 필요에 따라 자유자재로 변형하여 이용할 수 있는 시스템의 개발과 중요성이 전세계적인 관심사로 대두되면서 이를 위한 연구가 활발히 진행중이다. 이에 본 연구에서는 유전체 발현 시스템을 재구성 및 재설계하여 다양한 phenotype을 효과적으로 engineering할 수 있는 획기적인 기술로서 새로운 인공 전사 인자를 개발하였다. 인공 전사 인자는 다양한 DNA 결합 특이성을 나타내는 징크 핑거 DNA 결합 단백질(Zinc finger DNA-binding protiein)과 대장균(E. coli)의 전사 인사인 cyclic AMP receptor protein (CRP)을 이용하여 개발하였다. 구체적으로, 40개의 서로 다른 징크 핑거를 무작위로 조합하여 3개의 징크 핑거 도메인과 CRP effector 도메인으로 구성된 총 $6.4\times10^4$ 개의 인공 전사 인자를 제작하였다. 이와 같은 인공 전사 인자를 이용하여, 본 연구에서는 현재 생명공학 산업에서 가장 널리 이용되고 있는 산업균주인 대장균에서 phenotype의 다양성을 유도할 수 있었다. 이 중에서 특히 산업적으로 유용한 특성으로 그 개발이 중요시되고 있는 열, 삼투압, 저온에 대한 저항성을 보이는 대장균을 개발하였다. 또한, 열저항성을 유도한 특정 유전자들을 규명하여 열저항성에 대한 메커니즘을 밝혔다. 그리고 인공 전사 인자의 발현양의 조절을 통해 그로 인한 특정 phenotype의 변화 크기 역시 다양하게 조절이 가능하다는 것을 밝힐 수 있었다. 더 나아가, 본 연구에서는 전 세계적으로 주목받고 있는 바이오 에너지 산업 특히, 바이오 부탄올 대량생산에 인공 전사 인자의 이용가능성을 확대시켰다. 즉, 인공 전사 인자를 통하여 1.5% (vol/vol) 부탄올에 저항성을 가지는 동시에 열저항성을 가지는 대장균을 개발하고 부탄올 생합성 대사회로를 도입하여 wild-type 대장균에 비해 약 13% 가량 부탄올 생산성을 증가시킬 수 있었다. 이에 더하여, 인공 전사 인자를 native 부탄올 생산 균주인 클로스트리디움(Clostridium acetobutylicum)에 도입하여 부탄올 저항성 및 생산성을 동시에 향상시켰다. 특히, 부탄올 생산의 경우, 인공 전사 인자를 이용하여 wild-type 클로스트리디움에 비해 약 200% 가량 생산성을 증가시켰다. 이와 같은 결과로부터 본 연구에서 개발한 인공 전사 인자는 미생물의 다양한 phenotype을 효과적으로 개량 향상시킬수 있는 획기적인 기술로써 산업용 균주 개발뿐만 아니라 유전체의 기능 연구 및 규명(functional genomics study)에도 효과적으로 이용될 수 있다는 결론을 내릴 수 있었다.
