Due to its poor ability for self-repair, cell therapy procedures for the restoration of human articular cartilage have been developed. Articular chondrocyte implantion (ACI) is one such therapy wherein human articular chondrocytes (HACs) are isolated from a cartilage biopsy obtained from a patient, expanded in monolayer cultures and later injected back into the patient. The limited number of cells obtained from biopsy must be expanded into at least 10 million cells in order to be clinically applicable. For this purpose, serum, which stimulates high proliferation of the cells, is generally supplemented into the culture medium. Serum has several disadvantages, however, such as the limited availability of autologous serum and non-physiological responses from the cells due to its use. Therefore, the development and use of serum-free media (SFM) is a potential improvement for cell therapy procedures like ACI.
We performed a literature search regarding potential components for the development of a SFM that would result in expansion of HACs comparable to, or better than, serum-containing media (SCM). A composition for SFM was made and growth of HACs using this composition was examined. Expansion was observed and compared in a commercial medium designed specifically for chondrocyte cultures, serum-containing media (media supplemented with 10% fetal bovine serum; FBS) and the newly developed SFM using two different types of basal media. Results revealed that the SFM composition attained the best expansion in SFM based in Iscove’s modified Eagle’s medium (IMDM), which showed a 3.35-fold higher maximum cell density than HACs grown in SCM during long-term cultures. It was concluded that this SFM composition obtained from literature search would be acceptable for the expansion of HACs in subsequent studies.
Different basal media have differing medium osmolalities. Medium osmolality is a culture parameter which can have devastating effects on cell growth if not controlled. Due to the lack of serum, which has been shown to deter the negative effects of medium osmolality, in SFM, cells cultured without serum may be more sensitive to changes in this parameter. Therefore, we examined growth parameters of HACs expanded in proprietary SFM at various osmolalities (290-450 mOsm/kg) constructed by the adjustment of NaCl concentration. We found that growth of HACs in SFM was similar at osmolalities 290 to 350 mOsm/kg and that the maximum cell density was up to 1.55-fold better at these osmolalities than at 400 mOsm/kg, the average osmolality of cartilage $\It{in vivo}. In addition, we examined the tissue-forming capability of HACs expanded in 320 mOsm/kg SFM and compared it to the potential of HACs cultured in 400 mOsm/kg SFM. Results showed similar glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II contents in both groups. Taken together, these data show that HACs should be expanded in osmolality-controlled SFM, from 290 to 350 mOsm/kg, to obtain the best growth and that adjusting SFM osmolality in this way does not deter the tissue-forming capacity of the cells.
For the final step of this research, we elucidated the specific effects of medium osmolality on the expansion of HACs in SFM. A proteomic approach, which thus far, has been used to focus mainly on arthritic diseases in human articular cartilage, was used. By differential in-gel electrophoresis (DIGE), we explored protein expression changes resulting from the expansion of HACs in SFM at different osmolalities, 320 and 400 mOsm/kg. We found changes in expression in a total of 20 protein spots and, from these, 18 were identified as 7 different proteins. Proteins affected by the change in medium osmolality were identified to function in the cytoskeleton, protection against reactive oxygen species, mRNA biogenesis and the heat shock response, which all correlate with the cell cycle and proliferation. It was also found that no protein expression changes existed regarding chondrogenic markers, which supported our previous result that adjusting medium osmolality in SFM, while enhancing growth, does not affect the tissue-forming capability of HACs.
인간 관절 연골은 자가 치유능력이 떨어지기 때문에, 인간 관절 연골의 치유를 위한 세포 치료 과정이 개발되어 왔다. 자가연골세포 이식술은 인간 관절 연골세포를 연골 절제술을 사용하여 환자의 연골을 분리해 낸 후, 분리 세포를 단층 배양을 통해 증식시켜 환자에게 다시 주입하는 치료 방법이다. 절제술을 통해 얻은 제한된 수의 세포는 임상에서 사용하기 위하여 적어도 $10^7$개까지 증식을 시켜야 한다. 이를 위해, 일반적으로 세포를 자극하여 높은 수준으로 증식시키는 혈청을 배지에 첨가한다. 그러나 혈청을 사용할 경우, 자가 혈청의 공급이 제한적이며 비생리적 반응을 일으킬 수 있다는 점에서 여러 단점을 지닌다. 그러므로, 무혈청배지의 개발과 사용이 자가연골세포 이식술과 같은 세포 치료의 잠재적 향상을 이끌어낼 수 있다.
그동안 인간 관절 연골세포의 증식을 위한 무혈청배지를 개발하려는 노력이 이루어져 왔다. 무혈청배지의 개발은 호르몬, 성장인자, 비타민, 아미노산, 단백질, 지질을 비롯한 여러 영양분의 종류와 농도를 바꾸어 기본 배지에 첨가하여야 하기 때문에 다소 지루하고 시간이 걸리는 작업이다. 또한, 인간 관절 연골세포의 증식을 위한 배지 개발 시, 연골세포의 표현형을 유지하는 것은 연골세포의 증식 잠재성만큼 중요하다. 연골세포에는 증식함에 따라 분화되었을 때의 표현형을 잃는 탈분화하는 성질이 있다는 것은 잘 알려진 사실이다(Binette et al., 1998; Dell’Accio et al., 2001; Schnabel et al., 2002; Diaz-Romero et al., 2005; Yang et al., 2006; Carossino et al., 2007; Barlic et al., 2008; Lin et al., 2008). 이러한 이유로 연골세포의 증식을 위한 무혈청배지는 세포의 증식을 증진시키는 인자와 연골세포의 표현형을 잃는 것을 지연시키거나 방지하는 성분을 포함하여야 한다. 본 연구에서는 노령 환자들에게서 얻은 인간 관절연골세포의 증식을 위한 무혈청배지를 개발하였다. 또한, 무혈청배지의 삼투압을 관절 연골세포의 생체 내에서의 삼투압에 비해 낮게 조절해 주었을 때 인간 관절 연골세포의 증식이 증진되는 것을 관찰하였다. 마지막으로, 증식 차이의 잠재적 원인을 찾기 위해 무혈청배지의 두 가지 삼투압 환경에서 인간 관절 연골세포의 단백질 발현 양상의 차이를 분석하였다.
혈청의 단점을 보완하기 위하여 화학적 규명 무혈청배지가 개발되었다. 연골세포의 무혈청배지에 관한 문헌을 통해 기본 배지에 첨가할 성장 인자와 다른 성분들을 정리하였다. 성장인자로는 형질전환성장인자, 섬유아세포성장인자, 인슐린유사성장인자, 혈소판유래성장인자와 상피세포성장인자가 사용되었고, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, 에타놀아민, 아스코르브산을 비롯한 다른 성분들이 화학적 규명배지의 첨가물로 사용되었다. 문헌에서 얻은 정리된 정보를 사용하여, 인간 관절 연골세포의 배양을 위한 무혈청배지의 개발을 완성하였다. 인간 관절 연골세포의 성장에 대한 효과는 무혈청배지와 연골세포 배양을 위한 상업적 배지, 혈청 포함 배지의 세 가지 배지에서 관찰하였다. 추가적으로, 기본 배지를 바꾸는 실험을 수행하였다. 결과적으로 상업적 배지와 혈청 포함 배지는 비슷한 성장을 보였다. 무혈청배지의 경우, 혈청배지에 비해 비슷하거나 높은 수준의 성장을 보이지 못했지만 무혈청배지의 기본 배지를 바꾸었을 때 배양이 끝날 시기의 세포 밀도가 혈청 포함 배지에 비해 2.32배 높게 나타나는 것을 확인하였다. 그러므로, 기본 배지를 잘 선택한다면 혈청 포함 배지를 문헌을 통해 만든 구성 성분을 포함한 무혈청배지로 대체할 수 있다. 본 실험에서는 Iscove’s modified Eagle’s 배지(IMDM)를 사용하였다. 또한, 향후 연구에 있어서 인간 관절 연골세포의 증식을 위해 본 실험에 사용한 무혈청배지의 구성 성분을 적용할 수 있을 것으로 기대된다.
기본 배지의 경우 각각 다른 배지 삼투압을 지닌다. 배지의 삼투압은 조절이 되지 않을 경우 세포의 성장을 파괴할 수도 있는 배양 요소이다. 혈청이 포함된 배지의 경우 혈청이 배지 삼투압이 세포에 주는 효과를 억제하여 세포가 삼투압에 민감하게 반응하지 않지만, 무혈청배지의 경우 혈청이 없기 때문에 삼투압의 변화에 대해 세포가 민감한 반응을 보이게 된다. 그러므로, 염화나트륨 농도의 조절을 통해, 본 실험실에서 개발한 무혈청배지를 다양한 삼투압(290, 320, 350, 400, 450 mOsm/kg)으로 만들어 변화시키면서 삼투압에 대한 인간 관절 연골세포의 증식을 실험하였다. 이를 통해 인간 관절 연골세포의 평균적인 생체 내 삼투압인 400 mOsm/kg에 비해 낮은 삼투압의 무혈청배지에서 인간 관절 연골세포가 더 잘 증식함을 확인하였다. 290, 320, 350 mOsm/kg의 무혈청배지에서는 400 mOsm/kg의 무혈청배지와 비슷한 성장을 보이며, 증식속도가 1.55배 증가하였다. 무혈청배지의 삼투압을 450 mOsm/kg까지 증가시키면 400 mOsm/kg의 무혈청배지에 비해 0.65배 낮은 증식 속도를 보였다. 연골 분화 능력은 320 mOsm/kg과 400 mOsm/kg의 무혈청배지에서 증식된 연골세포를 연골세포 배지에서 3차원 펠릿 배양을 하여 실험하였다. 생화학적, 조직구조학적, 면역조직화학적 분석을 통해 실험한 결과, 글리코사미노글리칸과 콜라겐 타입 II는 두 경우 모두 비슷한 것을 관찰하였다. 종합적으로, 인간 관절 연골세포를 무혈청배지에서 배양할 경우 $290\sim320$ mOsm/kg의 범위 내에서 삼투압을 맞추어 사용하면 인간 관절 연골세포 증식이 증진되며 단층 배양 시 배지의 삼투압을 조절하는 것이 세포의 조직 형성 능력을 떨어뜨리지 않는 다는 것을 확인하였다.
본 연구의 마지막 단계로, 320 mOsm/kg과 400 mOsm/kg의 두 가지 삼투압의 무혈청배지에서 인간 관절 연골세포를 단층 배양하고, 단백질 성분의 변화를 관찰함으로써 배지 삼투압의 특별한 효과를 규명하였다. 단백질체학적 접근은 인간 관절 연골의 관절염에 주로 초점을 맞추어 왔다. 320 mOsm/kg, 400 mOsm/kg 무혈청배지에서 인간 관절 연골세포를 증식시키고 전기영동(DIGE)을 수행함으로써, 단백질의 발현을 연구하였다. 전체적으로 20개의 지점에서 단백질의 발현의 차이를 찾았다. 매트릭스 보조 레이저 이온화-비행 시간형(MALDI-TOF/TOF) 질량분석기를 사용하여 20개의 지점 중 18개의 지점을 분석하여 7가지 다른 단백질을 밝혔다. 무혈청배지의 더 높은 삼투압에 영향을 받은 단백질들이 밝혀졌고 이들은 세포 골격에서 작용하며, 활성 산소 종에 대해 보호하고 mRNA 생합성과 열충격에 대한 반응을 일으키는 것으로 알려져 있다. 모든 단백질들은 세포 주기와 증식에 관련되어 있었으며, 이는 배지의 삼투압의 조절이 무혈청배지에서 인간 관절 연골세포의 증식에 중요하다는 것을 강조하는 것이다. 또한, 연골 분화 능력의 표지에 관해서는 단백질 발현의 차이가 없었다. 이는 무혈청배지의 삼투압 조절이 세포의 성장은 증진시키고, 인간 관절 연골세포의 조직 형성 능력은 저해하지 않는다는 이전 결과와 동일한 결과이다.
