In the multicellular organisms, highly-branched blood and lymphatic vascular networks are responsible for transporting gases, nutrients, signaling molecules and circulating cells between tissues and organs through the body. The vascular networks are formed by endothelial cells which are tightly regulated to maintain the homeostasis in the organism via various signaling pathways. Occasionally, dysfunction in the vascular networks is associated with many diseases such as cancer and cardiovascular diseases. In early embryonic development, endothelial cells aggregate to form primitive blood vessels (vasculogenesis). Once the blood circulation becomes established, initial vascular plexus develops into a complex and functional vascular structure through various vascular remodeling processes such as endothelial cell sprouting, pruning, and vascular branching (angiogenesis). Vascular endothelial growth factor (VEGF)/VEGF receptor and angiopoietin/Tie receptor system have been identified to be endothelial cell-specific and essential for the formation and maintenance of vascular network not merely in embryonic development but also in the adult life.
Here, I divided this thesis into three chapters as follows: the development of lymphatic vessels in the mouse intestine (part I), role of VEGF-C,D/VEGFR-3 system in inflammation-induced lymphangiogenesis (part II), and role of angiopoietins/Tie2 system in angiogenesis and lymphangiogenesis (part III).
$\Bf{Part I. Abstract}$
Lymphatic vessels in the small intestine serve as essential conduits for the absorption and transport of lipids from the intestine to the thoracic duct. Although the morphology and function of the intestinal lymphatic vasculature are well known, little is known about the embryonic development of these vessels. In this study, I examined development of lymphatic and blood vasculatures in the intestinal tube during mouse embryonic development by immunostaining with recently discovered molecular markers for lymphatic endothelial cells: LYVE-1, VEGFR-3, Prox-1, and podoplanin. Immature lymphatics became detectable in mesentery, but not in intestinal tube, around E13.5-E14.5, while organized lymphatic vessel plexuses and capillaries were observed in intestinal tube and villi around E17.5. These lymphatic plexuses and capillaries in the intestinal tube appeared to be formed through an active branching process associated with activation of VEGFR-3 and involvement of LYVE-1+ macrophages. These data also reveal that the lymphatic vessels in the intestinal tube, unlike the blood vessels, have not originated from the mesoderm of intestine. All lymphatic vessels in the intestinal tube are originated by extension of mesenteric lymphatic vessels through an active branching process. Although the formation of lymphatic vessels follows the formation of blood vessels in the intestine, a mature lymphatic vasculature is formed before birth. Together, this study reveals the temporal and spatial windows of intestinal lymphatic development during embryonic development in mouse.
$\Bf{Part II. Abstract}$
Lymphatic vessels in the diaphragm are essential for draining peritoneal fluid, but little is known about their pathologic changes during inflammation. Here I characterized diaphragmatic lymphatic vessels in a peritonitis model generated by daily intraperitoneal administration of lipopolysaccharide (LPS) in mice. Intraperitoneal LPS increased lymphatic density, branching, sprouting, connections, and network formation in the diaphragm in time- and dose-dependent manners. These changes were reversible upon discontinuation of LPS administration. The LPS-induced lymphatic density and remodeling occur mainly through proliferation of lymphatic endothelial cells. CD11b+ macrophages were massively accumulated and closely associated with the lymphatic vessels changed by intraperitoneal LPS. Both RT-PCR assays and experiments with VEGF-C,D blockade and macrophage-depletion indicated that the CD11b+ macrophage-derived lymphangiogenic factors VEGF-C,D could be major mediators of LPS-induced lymphangiogenesis and lymphatic remodeling through paracrine activity. Functional assays with India ink and FITC-microspheres indicated that impaired peritoneal fluid drainage in diaphragm of LPS-induced peritonitis mice was due to inflammatory fibrosis and massive attachment of CD11b+ macrophages on the peritoneal side of the diaphragmatic lymphatic vessels. These findings reveal that CD11b+ macrophages play an important role in intraperitoneal LPS-induced aberrant lymphangiogenesis and lymphatic dysfunction in the diaphragm.
$\Bf{Part III. Abstract}$
To investigate and compared the in vivo effects of all four angiopoietins (COMP-Ang1, Ang2, Ang3, and Ang4) on blood and lymphatic vascular remodeling in adult mice, I analyzed the microvasculature of trachea and ear skin, and compared quiescent skin microvasculature with that during wound healing. Similar levels of relatively long-term and sustained circulating expression of each angiopoietin using an adenoviral delivery system were achieved. Two weeks after treatment, I observed tracheal blood and lymphatic vascular enlargement, and lymphatic filopodia formation, with the following order of potency: $COMPAng1 \gt Ang3 = Ang4 \gt Ang2$. Co-treatment with Ang2 attenuated COMP-Ang1-induced tracheal blood and lymphatic remodeling. In the normal ear skin, all angiopoietins induced blood vessel enlargement, whereas none induced lymphatic vascular remodeling. However, in the healing margin of ear skin wounds, all angiopoietins strongly induced lymphatic vascular enlargement and formation of lymphatic sprouts and filopodia, while they potentiated blood vascular enlargement. Co-treatment of Ang2 with COMP-Ang1 produced an additive effect on these changes. This study, one of the first to our knowledge to characterize the in vivo actions of all 4 angiopoietins, may expand the current concepts for use of angiopoietins for therapeutic angiogenesis and lymphangiogenesis.
혈관과 림프관은 다세포생물 내의 조직 또는 기관들 사이에서 가스, 영양분, 신호전달 물질과 세포들을 이동시키는 역할을 한다. 태생기 발생 과정에서 맥관형성 (Vasculogenesis) 과정에 의해 형성된 초기 혈관망은 혈관신생 (Angiogenesis) 과정에 의해 복잡하고 기능적인 혈관구조로 발달하게 된다. 혈관과 림프관은 혈관내피세포로 이루어져 있으며, 이들 세포는 항상성을 유지하기 위해 다양한 신호전달에 의해 정확하게 조절된다. 혈관내피세포의 기능에 이상이 생기는 것은 종종 암이나 심혈관계 질환을 포함한 다양한 질병의 원인이 된다. VEGF/VEGF 수용체와 angiopoietin/Tie 수용체 시스템은 혈관내피세포에 특이적으로 작용하며, 혈관구조의 형성과 유지에 필수적인 역할을 한다. 이 논문은 세 개의 장으로 나누어 생쥐 소장에서 림프관의 발달과정, 염증반응에 의한 림프관 신생과정에서 VEGF-C,D/VEGFR-3 시스템의 역할, 그리고 혈관 신생과 림프관 신생과정에서 angiopoietins/Tie2 시스템의 역할에 대해 밝힘으로써, VEGF/VEGF 수용체와 angiopoietin/Tie 수용체 시스템이 혈관 및 림프관 리모델링 과정에서 수행하는 역할에 대해 밝혀내었다.
소장내의 림프관은 지질성분을 흡수하여 흉관으로 이동시키는 중요한 통로로써 작용하지만, 발달과정에 대해서는 잘 알려져 있지 않았기 때문에 본 연구자는 생쥐 배아에서 소장 내 림프관 발달과정을 림프관 특이적 마커인 LYVE-1, VEGFR-3, Prox-1과 Podoplanin을 이용한 면역염색법을 이용하여 밝혀내었다. 소장 내 림프관은 혈관 형성 이후에 이루어지나, 성숙한 림프관으로 발달은 출생 이전에 완료된다. E13.5-14.5 시기에 처음으로 장간막 내 미성숙 림프관이 확인되었으며, E17.5 시기에 소장 내 융모관의 림프관이 관찰된다. 본 실험결과에서 혈관과는 달리 소장내의 림프관은 중배엽으로부터 유래된 것이 아니며, 장간막 림프관의 활발한 branching 과정에 의해 형성된 것이며, 이 과정에서 VEGFR-3의 활성화와 LYVE-1+ 대식세포가 관련이 있다는 것과 함께 생쥐 소장내의 림프관 발달과정의 dynamics를 처음으로 밝혀내었다.
횡격막 림프관은 복막 내 수액의 흡수 및 이동에 중요한 역할을 수행하지만, 염증반응이 일어나는 과정에서 림프관의 병리적 변화에 대해서는 거의 알려져 있지 않았기 때문에 본 연구자는 Lipopolysaccharide (LPS)를 생쥐의 복강에 주입하여 복막염 모델을 만들어 횡격막 림프관에서의 변화를 관찰하였다. 복강 내 주입된 LPS는 림프관 리모델링을 가역적으로 증가시켰으며, 림프관 리모델링은 주로 림프관 내피세포의 증식과 sprouting에 의해 유도된다는 것을 확인하였다. LPS의 주입은 다량의 CD11b+ 대식세포를 횡격막 림프관으로 유도하는데 이들 대식세포가 림프관 신생인자인 VEGF-C 와 D 를 분비하는 paracrine 작용으로 결국 림프관 리모델링을 유도한다는 것을 밝혀냈다. 잉크와 형광구체를 이용한 림프관 기능 분석 실험은 생쥐 복막염 모델에서 림프관의 기능에 이상이 있음을 보여주었고, 이것은 염증성 섬유증과 다량의 CD11b+ 대식세포의 유입에 의한 결과임이 확인되었다. 본 실험결과를 통해 생쥐 복막염 모델에서 LPS에 의해 유도되는 CD11b+ 대식세포가 구조적, 기능적으로 비정상적인 횡격막 림프관 신생과정에서 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다.
혈관 신생 및 림프관 신생과정에서 angiopoietin (COMP-Ang1, Ang2, Ang3 및 Ang4)의 생체 내 효과를 확인하고 비교하기 위해 아데노 바이러스 전달방법을 이용한 시스템을 확립하여 높은 농도의 angiopoietins이 생쥐의 혈청 내 유지되도록 한 뒤, 기도 점막과 귀 피부 조직에서 혈관 과 림프관을 관찰하였다. 서로 다른 내피세포 환경을 조성하기 위해 quiescent한 기도 점막과 귀 피부 조직 그리고 직경 0.5 cm 의 상처를 낸 후 치유되는 과정의 귀 피부 조직을 관찰하였으며, Ang2가 생체 내에서 agonist로 작용하는지 antagonist로 작용하는지를 확인하기 위해 COMP-Ang1과 Ang2를 병합 투여한 실험군을 추가하였다. Angiopoietins를 발현하는 아데노 바이러스 주입 2주 후에 $COMP-Ang1 \gt Ang3 = Ang4 \gt Ang2$ 의 순서로 생쥐의 quiescent한 기도 점막에서 혈관 신생 및 림프관 신생을 유도한 것을 확인하였고, COMP-Ang1과 Ang2를 병합 투여군에서 Ang2가 COMP-Ang1에 의해 일어나는 리모델링을 억제시키는 antagonist로 작용 함을 밝혀내었다. 상처치유가 일어나는 귀 피부 조직에서는 모든 angiopoietins이 혈관 신생뿐만 아니라 림프관 신생을 강하게 유도하였고, 많은 림프관 sprouting과 filopodia를 생성하였다. 흥미롭게도, Ang2가 quiescent한 기도 점막 조직과는 달리 COMP-Ang1과 함께 agonoist로 작용하여 부가적인 혈관 및 림프관 신생효과를 가져왔다. 본 실험결과는 4가지의 angiopoietins이 혈관 및 림프관 신생과정에서의 생체 내 효과를 확인함으로써 나아가 이들이 치료를 목적으로 유용하게 이용될 수 있는 가능성을 제시하는 결과를 보여주었다.
