Lipopolysaccharide (LPS), the Gram-negative bacterial outer membrane glycolipid, induces sepsis through its interaction with myeloid differentiation protein-2 (MD-2) and Toll-like receptor 4 (TLR4). To block interaction between LPS/MD-2 complex and TLR4, I designed and generated soluble fusion proteins capable of binding MD-2, dubbed TLR4 decoy receptor (TOY) using ‘the Hybrid leucine-rich repeats (LRR) technique’. TOY contains the MD-2 binding ectodomain of TLR4, the LRR motif of hagfish variable lymphocyte receptor (VLR), and the Fc domain of IgG1 to make it soluble, productive, and functional. TOY exhibited strong binding to MD-2, but not to the extracellular matrix (ECM), resulting in a favorable pharmacokinetic profile $\It{in vivo}$. TOY significantly extended the lifespan, when administered in either preventive or therapeutic manners, in both the LPS- and cecal ligation/puncture-induced sepsis models in mice. TOY markedly attenuated LPS-triggered NF-kappaB activation, secretion of proinflammatory cytokines, and thrombus formation in multiple organs. Taken together, the targeting strategy for sequestration of LPS/MD-2 complex using the decoy receptor TOY is effective in treating LPS- and bacteria-induced sepsis; furthermore, the strategy used in TOY development can be applied to the generation of other novel decoy receptor proteins.
우리 인체는 외부의 세균이나 바이러스와 같은 병원체로부터 스스로를 보호하기 위한 면역 체계를 구축하고 있다. 이러한 면역 체계는 크게 두 가지로 나누어 볼 수 있는데, 첫째는 비특이적 반응으로써 병원체들을 즉각적으로 제거하는 선천성 면역 (innate immunity) 이요, 둘째는 병원체에 대한 특이적 항체를 생성하여 반응하는 적응성 면역 (adaptive immunity) 이다.
Toll-like receptor (TLR) family 는 선천성 면역에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 형태 인지 수용체 (pattern recognition receptor) 의 일종이다. 즉 인체가 외부의 세균이나 바이러스와 같은 병원체에 의해 감염 되면 각각의 TLR 들이 그들이 담당하는 병원성 분자 형태 (pattern) 를 인식하고 하부 신호전달을 활성화 시킴으로써 염증 반응을 유도하여 일련의 숙주 방어 체계를 가동 시키게 되는 것이다.
그러나 외부로부터의 세균이나 바이러스성 감염이 매우 심해지는 병적인 상황에 처하게 되면 이러한 신호전달이 너무 과하게 활성화 되고, 그에 따라 염증 촉진 인자들의 발현 역시 무분별하게 증가하게 된다. 따라서 몸 전체에 염증 반응이 일어나게 됨으로 인하여 패혈증과 같은 몇몇 질병들이 유발되게 되는 것이다. 즉 패혈증은 감염에 의해 일어나는 몸 전체에서의 염증 반응이라고 할 수 있으며, 그에 대한 증상으로는 호흡이나 맥박이 빨라지고, 심한 경우에는 여러 장기가 손상되어 그 기능을 하지 못하며 결국에는 죽음에까지 이르게 되는 심각한 질병이다.
이러한 패혈증을 유발하는 데에 있어서 매우 중요한 역할을 수행한다고 알려지고 동시에 그만큼 널리 연구된 것들 중 한 가지가 바로 Toll-like receptor 4 (TLR4) 이다. TLR4 는 그람 음성균의 세포벽 구성 성분이자 내독소 (endotoxin) 의 일종인 Lipopolysaccharide (LPS) 에 대한 수용체로써, 보조 수용체인 MD-2 와 더불어 LPS 에 대한 면역 반응을 일으키는 기능을 담당한다. 따라서 이와 같은 LPS-TLR4 관련 신호전달을 표적으로 하는 패혈증 치료제의 개발이 십여 년 동안 이루어져 왔으나, 현재까지는 탁월한 효과를 보이는 패혈증 치료제가 존재하지 않고 있는 실정이다.
본인은 이번 연구를 통하여 패혈증 치료용 단백질 신약후보물질이라고 할 수 있는 TLR4 미끼 수용체 (decoy receptor) 를 개발하고, 이를 TOY 라고 명명하였다. TLR4 고유의 특성인 저발현 문제는 ‘Hybrid LRR technique’ 을 적용하여 극복할 수 있었고, Fc 부분을 융합함으로써 더욱 안정적인 수용성의 재조합 단백질을 만들어 내었다. 또한 TOY 를 대량생산하기 위해 CHO 세포를 이용한 세포주를 확립하여 단백질 정제 과정까지 성공적으로 마칠 수 있었다. 이러한 TOY 는 TLR4 본래의 결합 상대 단백질인 MD-2 또는 LPS/MD-2 복합체와 적절하게 상호작용 할 수 있음을 확인하였고, 세포 수준에서의 실험을 통해 LPS 에 의한 염증 반응을 억제함을 관찰할 수 있었다.
더 나아가, TOY 에 대한 여러 생화학적인 분석들을 통해 치료제로써의 개발 가능성을 확인할 수 있었으며, 생쥐를 이용한 두 가지 패혈증 모델에서의 효능을 검증하였다. 그 결과 TOY 를 주사한 패혈증 모델 생쥐에서 치사율이 현저하게 줄어들었음은 물론이요, 그 원인으로 NF-κB 의 활성화 및 여러 염증성 사이토카인 (cytokine) 의 발현, 다양한 장기 손상 측면에서 질병이 매우 호전된 양상을 보임을 관찰할 수 있었다.
본 연구 결과는 TLR4 미끼 수용체를 이용한 전략이 TLR4 신호전달을 표적으로 하는 패혈증 치료에 있어서 실제 동물 모델에서도 매우 적합하다는 것을 세계 최초로 증명한 예라고 할 수 있겠다. 또한 생체 내에서 TLR4 의 A patch 부분 만으로도 MD-2 에 결합하는 데에 충분하다는 단서를 제공함으로써 추후에 있을 응용 연구에 보탬이 되는 구조적 정보를 제공하는 계기가 되었다. 그리고 이러한 ‘Hybrid LRR technique’ 은 또 다른 단백질 신약, 재조합 단백질 제작 등에 무궁무진하게 응용될 수 있다는 것을 재확인 하였으며, TOY 는 패혈증 치료용 신약후보물질로써의 발전 가능성이 충분하다고 사료된다.