In this thesis, an efficient and accurate drug assay system in a microfluidic device was developed, considering the $\It{in vivo}$ delivery path of drugs in humans. Among the various drug assays, drug permeability assays in the intestine and brain, and hepatotoxicity assay in the liver are very important for drug screening and development process. The microfluidic assay system for drug permeability and hepatotoxicity assays using a cell trapping method reduces the assay time as no cell culture in the microfludic device is required and no complex structure, such as cellular membrane, is needed. The microhole array for cell trapping was fabricated using the poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molding technique for mimicking the intestinal epithelial cell membrane. Based on mathematical simulations, the configuration of the microfluidic device, including a microhole array and a mixing channel, and the flow rate were optimized to trap cells firmly in each microhole without cell damage. The permeability of ten drugs was measured and compared with the reported values of permeability in the human and rat intestine. On the other hand, drug transportation from blood to brain is restricted by the specialized membrane of brain capillary endothelial walls, namely blood brain barrier (BBB). With the same device, a permeability assay system was also performed using human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) trapped in microholes, with or without astrocyte conditioned medium (ACM) in a microfluidic device. From the permeability assays of five widely used drugs for measuring BBB permeability, the measured permeability values were highly correlated with the permeability value of $\It{in vitro}$ BBB model and brain uptake index (BUI). Hepatocytes have been used for $\It{in vitro}$ hepatotoxicity assays because of their ability to sustain intact liver-specific function. In order to investigate drug effects on hepatic function using primary human hepatocytes, hepatotoxicity assays of several drugs were performed in the microfluidic device. LC50 values of the drugs assayed using the device were similar to those from the in vitro toxicity assays with human hepatocytes obtained from the literature. This novel assay system enabled us to assay $\It{in vivo}$-like drug assays with a short assay time, by exploiting microstructures mimicking the microenvironment of the intestine and liver.
대부분의 약물은 장내 상피세포에 의해 흡수 되며 흡수된 약물은 간으로 이동하여 대사가 이루어지게 된다. 특히 뇌를 타깃 (target)으로 하는 약물의 경우 뇌의 상피세포를 통해 다시 한번 흡수된다. 뇌의 상피세포는 장내의 상피세포와는 달리 세포와 세포 사이의 강한 결합을 가지고 있으며 이를 혈액-뇌 관문 (blood brain barrier, BBB) 이라고 한다. 뇌로 가는 약물 중 이러한 BBB를 통과하여 흡수되는지의 여부를 아는 것은 뇌를 타깃으로 하는 약물 개발에 있어 매우 중요하다. 또한 약물개발 단계에서 실패하는 원인의 50% 이상이 약물의 흡수도와 관련되어 있고 30% 정도가 독성과 부작용 때문임을 감안할 때 약물의 흡수도와 독성을 정확하고 빠르게 예측하는 것은 약물 개발 과정에 있어 매우 중요한 요인으로 작용한다.
본 논문에서는 미세유체소자를 이용하여 약물의 흡수와 독성을 측정할 수 있는 시스템을 구축하였으며 미세유체소자 내에 형성된 마이크로 홀에 세포를 포획하는 방법을 이용하여 세포 배양을 하지 않고도 빠른 시간 내에 약물의 흡수와 독성을 측정할 수 있도록 하였다. 또한 본 미세유체 시스템을 이용하여 미세소자 내에서 유체가 지속적으로 세포에 영향을 미치도록 하는 환경은 실제 생체 내의 환경과 유사하며, 실제 인간의 생체 내에서 일어나는 약물의 흡수 및 독성의 결과까지도 예측 가능하게 한다.
본 연구에서 개발된 미세유체소자는 내부에 마이크로홀 어레이 (microhole array)를 가지고 있으며 이곳에 세포를 단일막 (monolayer)으로 고정하기 위한 최적의 유속과 마이크로홀 어레이의 각도를 시뮬레이션 및 실험을 통하여 정하였다. 또한 약물을 이용한 흡수도 평가 실험이 가능한지 검증하기 위하여 형광물질을 이용하여 약물이 세포에 의해 흡수되는 지를 확인하였다. 또한 실제로 기존의 약물의 흡수도 측정에 널리 이용되는 10가지 약물을 선정하고 세포에 의해 흡수되어 나온 약물을 미세유체 소자의 배출부에서 얻어내어 HPLC를 이용하여 측정하였고. 측정된 약물의 농도는 본 시스템에 흡수도 분석 계산식을 이용하여 흡수율을 계산하였다. 미세유체 소자를 이용한 약물의 흡수도 측정 결과를 실제 human $\It{in vivo }$ 와 rat $\It{in vivo }$ 환경에서의 흡수도 분석결과, 미세유체 소자를 이용한 약물의 흡수도는 쥐의 생체내 약물 흡수도 보다 인간의 생체내 약물 흡수도와 더욱 유사하다는 결과를 얻을 수 있었다. 이는 미세유체 소자를 이용한 약물의 흡수도 측정법이 실제 인간의 약물 흡수도를 예측하는 대체 방법이 될 것임을 예상할 수 있게 한다.
이러한 결과를 바탕으로 본 미세유체 소자를 뇌의 BBB를 통과한 약물의 흡수도 측정에도 적용하였다. 뇌의 혈관과 유사한 특징을 보이는 HUVECs (Human Umbilical vain endothelial cells)와 이와 상호작용을 통하여 더 강한 BBB를 형성하는 것으로 알려진 성상세포 (astrocyte)를 이용하였다. 성상세포를 5일간 배양한 배지 (astrocyte conditioned medium, ACM)를 이용하여 실제 미세유체소자 내에서 BBB를 모사하고 실제로 약물의 흡수도를 측정한 결과 ACM이 있을 때 BBB가 더 강하게 형성되어 약물의 흡수도가 낮아지는 것을 확인할 수 있었고 사진을 통하여 세포 사이의 강한 결합 (tight junction)이 형성되어 있는 것도 확인할 수 있었다. 또한 실제로 뇌와 관련된 5 가지 약물의 흡수도를 측정한 결과, 기존의 모델과 유사한 결과를 나타내었다. 따라서 본 시스템은 뇌를 타깃으로 하는 약물이 BBB를 얼마나 통과하는 지를 실시간으로 측정할 수 쓰일 수 있으며, 뇌 관련 질환과 연관된 다양한 약물의 스크리닝 (screening)을 효율적이고 간편하게 할 수 있는 새로운 대체 방법이 될 것이다.
약물의 독성 측정을 위해서는 미세유체 소자 내에 마이크로 홀 구조물에 인간의 간세포를 고정하고 약물을 흘린 다음 시간에 따라 세포가 사멸하는 비율을 계산하였다. 약물의 흡수도 측정을 위한 미세유체 소자와 유사한 구조를 가지나 형광물질을 혼합하기 위한 혼합 채널을 제외하여 세포에 미치는 유체의 압력을 최소화 하고자 하였다. 미세유체 소자 내에 존재하는 마이크로 홀 구조물에 세포가 고정된 다음, 반대편으로 흐르는 약물을 흡수하게 되고 약물의 독성 정도에 따라 세포가 사멸하는 수가 달라지게 된다. 미세유체 소자 내에서 약물의 독성 측정 결과, 시간에 따라 세포의 사멸수가 점차 증가하였고 반대로 살아있는 세포의 수가 점차 감소하는 것을 확인하였다. 또한 약물의 농도가 높아질수록 세포가 사멸하는 시간이 점차 빨라지는 것을 알 수 있었으며 약물의 농도에 따라 LC50 값을 측정할 수 있었다. 그 결과 benzopyrene 의 경우가 약물에 가장 민감하다는 것을 알 수 있었고 이는 세포가 가지는 약물에 대한 민감도를 미세유체 소자를 통해 알 수 있다는 것을 증명해준다. 또한 미세유체 소자 내에서 측정된 약물의 독성은 기존의 인간의 간세포를 이용하여 MTT assay 방법 및 실제 인간의 생체 내에서의 독성 정도와도 거의 유사하였다. 이를 통하여 미세유체 소자를 이용한 약물 독성 측정 방법이 기존의 방법을 대체하여 빠르고 효율적인 독성 예측이 가능하도록 하리라는 것을 알 수 있다.
본 미세유체 소자를 이용한 약물 분석 시스템은 약물의 흡수도와 독성을 측정함으로써 기존의 시스템을 대체하여 세포 배양 없이도 빠르고 효율적인 분석이 가능하다는 것을 보여주며, 앞으로 신약 개발 및 연구에 있어서 값비싼 동물 실험을 대체함으로써 약물 개발에 소요되는 시간과 비용을 획기적으로 절약할 수 있음을 시사한다. 또한 약물의 흡수도와 독성을 동시에 수행할 수 있는 소자의 기반이 되는 본 미세유체 소자는 HTS (high-throughput screening) 의 가능성도 내재하고 있다. 이와 같이 미세유체 소자를 이용한 약물 분석 시스템은 국내의 신약 개발 및 약물 분석 스크리닝에 큰 도움이 될 수 있을 것이다.
