The emergence and rapid horizontal spread of antibiotic-resistant traits in bacteria of human and veterinary clinical significance has been a driving force in the search for new classes of antibiotics. Antimicrobial peptides (AMPs) have received increasing attention as new antimicrobial substances because these peptides show a direct killing activity against a wide range of microorganisms and they possess antimicrobial activity against pathogenic microorganisms that are resistant to the conventional antibiotics with minimal inhibitory concentration as low as 0.25-4 μg/ml.
Numerous biological expression systems have been introduced for cost-effective production of AMPs for pharmaceutical applications. Among them, expression of AMPs in Escherichia coli causes several problems such as the toxicity of AMP to the host cell, its susceptibility to proteolytic degradation and decreased antimicrobial activity due to the additional residue(s) introduced after cleavage of AMPs from fusion partners. Here, we describe a novel prokaryotic expression system for the production of cationic AMPs. The method relies on a translationally coupled two-cistron system, in which the termination codon for the first cistron (which encodes the anionic polypeptide mIFc2, a derivative of human interferon-γ) overlaps with the initiation codon for the second cistron (which encodes a cationic AMP) in the sequence of 5′-TAATG-3′. By forming an insoluble complex with the AMP upon translation, the mIFc2 protein efficiently neutralized the toxicity of the co-expressed cationic AMP and minimized the sensitivity of AMP to proteolytic degradation in a host. The AMPs were retrieved from the insoluble inclusion bodies without any chemical or enzymatic cleavage step by simple cation-exchange chromatography.
With our system, about 100 mg of various AMPs (buforin IIb, parasin I, and pexiganan) were obtained from a 1 L Escherichia coli culture. In addition, fed-batch fermentations were carried out for the large-scale production of AMPs, about 500mg of AMP (buforin IIb) was obtained from 3 L Escherichia coli culture. Our expression system may represent a universal cost-effective solution for the mass production of intact AMPs in their natural forms. This work is very helpful to further apply the recombinant AMPs to new generation antibiotics and human therapeutics.
항균 펩타이드는 자연계에 존재하는 거의 모든 생명체가 외부 침입균으로부터 자신을 보호하기 위해 1차적 방어물질로 생산하는 물질로, 최근에는 체내 면역 기능 강화에도 중요한 역할을 하고 있음이 보고되면서 더욱 중요함을 인정받고 있다. 뿐만 아니라, 항균 펩타이드는 기존의 항생제가 가지고 있던 작용 기작과 차별화된 기작을 가져 항생제 내성균에도 활성을 나타내며, 반응 시간이 매우 짧아 점점 심각해지는 항생제 내성 문제를 해결할 수 있는 가장 유력한 후보물질로 주목 받고 있다. 그럼에도 불구하고 항균 펩타이드를 경제적으로 대량 확보 할 수 있는 생산 시스템은 제대로 확립되어 있지 않아서 항균 펩타이드의 이용에 치명적인 한계가 되고 있다. 따라서 본 연구에서는, 새로운 유전 공학 기법을 사용하여 항균 펩타이드를 효율적으로 대량 생산할 수 있는 시스템을 개발하였다.
항균 펩타이드를 대장균 내에서 단독 발현 시키면, 그 자체가 대장균에 독성을 띨 수 있으며, 작은 크기로 인해 발현율이 극히 적고, 대장균 내의 단백질 분해 효소에 의해 분해가 될 수 있다는 단점이 있다. 이를 극복하기 위하여 과발현 유도 시 inclusion body를 많이 형성하는 human interferon-γ 유도체 (mIF)를 co-expression partner로 도입하여 함께 발현시켜 독성 및 효소에 의한 분해를 막고, 이와 함께 발현시킬 항균 펩타이드와의 가장 최적화된 거리를 찾아 동반 번역 시킴을 통해 항균 펩타이드의 발현을 성공적으로 시킬 수가 있었다. 또한 acidic charge 를 가지는 mIF의 C-말단을 절단하여 길이를 줄여 제작한 여러 co-expression partner를 도입하여 항균 펩타이드의 발현 효율을 더욱 증대시킬 수가 있었다. 특히 이 방법은 fusion 발현 시스템과는 달리 항균 펩타이드를 fusion protein으로부터 분리시켜줄 cleavage step이 필요하지 않으므로, 시간적 비용적 효율이 매우 뛰어나며 생산 공정 중 발생할 수 있는 yield의 손실도 적다.
대장균 1L 플라스크 배양으로부터 항균 펩타이드 약 100mg 순수 분리할 수 있었고, 3L high cell density 배양으로부터 항균 펩타이드 약 500mg을 순수 분리할 수 있었다. 이와 같이 얻어진 재조합 항균 펩타이드는 원래의 항균 펩타이드와 동일한 항균 활성을 나타내었다.
이와 같은 생산 시스템은 지금까지 경제적 생물학적 생산 시스템으로 항균 펩타이드를 intact 형태로 대량 생산 시키지 못했던 한계를 극복할 수 있는 창의적이고 혁신적인 생산 시스템으로, 항균 펩타이드의 이용에 의미있는 발판을 제공하게 될 것이다.
