This thesis presents ‘hydrophoresis’, a novel flow-assisted separation principle for size separation of microparticles and cells. Hydrophoresis refers to the movement of suspended particles under the influence of a microstructure-induced pressure field. Particles subjected to lateral pressure gradients or flows induced by anisotropic microfluidic obstacles dynamically move from the one sidewall to the other sidewall without any active component. Therefore, hydrophoresis exhibits both advantages of field-based and flow-assisted methods that are dynamic particle manipulation and biocompatibility, respectively.
To demonstrate the hydrophoretic self-ordering of particles, I have designed and fabricated microfluidic obstacles slanted with respect to a fluid flow in a polymer device made of poly(dimethylsilosane). Experiments were performed with micron, submicron beads, and DNA molecules to verify the strong nature of hydrophoresis such as dynamic particle manipulation and biocompatibility. Micron-sized particles ranged from 10 to 15 μm were discriminated with less than 6\% resolution. DNA molecules of 49 and 115 kb were separated for 0.12 s over the channel length of 5 mm wtih the corresponding separation throughput of 1.7 × $10^6$ molecules/s.
For exact characterization of the hydrophoresis, I conducted three-dimensional (3D) measurement of particle positions in a hydrophoretic microchannel by using a mirror-embedded microchannel. The mirror ideally at 45 degrees reflects the side view of the channel and enables obtaining 3D positional information from two different orthogonal-axis images. With this method, I clearly revealed that hydrophoresis is governed by convective vortices and steric hindrance. I also observed that the hydrophoresis enables 3D particle focusing without sheath flows and an accurate flow-rate control.
I next developed a new class of a hydrophoretic device composed of slanted obstacles and filtration obstacles for effective separation of blood cells. Red blood cells (RBCs) are similar in diameter to that of white blood cells (WBCs), which makes difficult to separate two cell types based on their sizes. In the hydrophoretic filtration device, RBCs are aligned parallel to the filtration obstacles of 4.0 μm-height due to their small thickness and deformability, and thus pass through the obstacles, separating from WBCs. In the presented device, I separated WBCs from RBCs with an enrichment ratio of ~210-fold at a throughput of 4 × $10^3 s^{-1}$.
The final section of the thesis deals with the use of hydrophoretic size separation to sort cells in target phases of the cell cycle entirely based on a hydrodynamic principle. With this method, I found that there is a linear relationship between a cell’s size and its position distribution in a hydrophoretic device. I also demonstrate the robustness of the hydrophoretic method for practical applications by sorting cells in $G_0$/$G_1$ and $G_2$/M phases out of original, asynchronous cells with a high level of synchrony of 95.5\% and 85.2\%, respectively.
생체시료는 대게 혼합물형태로 존재하며 특정 세포 및 분자의 분석을 위해서 표적 세포 및 분자의 정제는 필수적인 전처리 과정이다. 표적 세포 및 분자의 정제를 위해서, 세포나 분자마다 다르게 갖는 고유의 표현형 (phenotype) 을 이용하게 되는데 이는 세포의 크기나 형태 또는 세포막 단백질일 수 있다. 본 논문에서는 여러 표현형 중 생체시료의 크기문제에 집중하며, 이를 효과적으로 해결하기 위한 기술로써 유체영동을 개발하여 DNA분자, 혈액세포의 분리 및 세포주기의 동기화에 응용함으로써 그 유용성을 검증하였다.
유체영동은 순수하게 유체역학적인 원리만을 이용해 생체시료의 크기문제를 해결하기 위한 기술로 개발되었다. 따라서 기존의 분리기술이 갖고 있던 문제점인 복잡한 제작공정, 세포의 생리활성도에 영향을 줄 수 있는 분리환경, 정교한 유동제어의 필요성을 없앰으로써 누구나 손쉽게 생체시료의 크기별 분리를 위해 유체영동을 이용할 수 있다. 유체영동을 위한 미세유체소자는 미세 가공 기술로 제작된 경사구조물을 주요한 구성요소로 갖는다. 경사구조물은 구조물의 측면에 비해 아랫면이 좁아 불균일한 유체저항을 갖고 있으며 이로 인해 유체유동방향의 수직으로 2차 대류유동을 유도한다. 이때 대류유동은 유체유동의 반시계방향으로 형성되며, 이러한 회전유동을 따라 입자가 외부의 물리력 없이 채널 내를 이동할 수 있게 된다. 이후 크기별 분리는 입자의 크기로 의한 입체 장해 (steric hindracnce) 현상에 의해 발생한다. 회전유동 중 입자는 경사구조물의 천장면으로 정렬한다. 이때 입자의 크기가 작을수록 천장면 가까이에 위치하며 더 큰 측면유동에 노출된다. 이 때문에 크기가 작은 입자일수록 측면유동에 더 많이 노출되어 이동하며, 유체영동에 의해 자기정렬하는 입자의 크기별 측면위치가 달라지게된다. 유체영동에 의한 입자의 자기정렬 및 크기분리는 500 nm에서 15 μm 사이의 크기를 갖는 미세입자를 이용해 검증하였다. 또한 49 kb 와 115 kb 크기를 갖는 DNA분자의 분리를 통해 유체영동에 의해 생체분자의 크기별 분리가 가능함을 확인하였다. 이러한 입자정렬실험을 통해서 입자의 크기와 경사구조물높이의 상대적인 차이가 입자의 자기정렬을 결정함에 있어 중요한 역할을 한다는 것을 밝혔다. 주어진 입자의 자기정렬을 위해선 경사구조물의 높이를 입자지름의 두배보다 작게 설계해야 한다.
경사구조물에 의해 유도된 대류유동은 3차원으로 변화하는 특성을 갖고 있다. 따라서 3차원 대류유동을 입자의 분리에 이용하는 유체영동의 원리를 규명하기 위해 입자의 유동궤적을 3차원으로 측정 및 예측하는 과정은 필수적이라고 할 수 있다. 유체영동의 3차원 측정을 위해 거울이 내장된 미세채널을 미세 제작 공정을 통해 제작하였다. 거울이 내장된 미세채널은 채널 내에 내장된 거울을 통해 반사된 측면위치와 정면위치를 동시에 측정할 수 있기 때문에 복잡한 광학장비없이 미세입자의 3차원 측정을 가능하게 한다. 이를 이용해 4 μm와 15 μm 크기를 갖는 미세입자의 유동궤적을 3차원으로 측정하였으며 이를 통해 유체영동의 원리를 증명할 수 있었다. 또한 입자의 크기에 의한 입체장해현상이 입자의 유동궤적에 어떠한 차이를 가져오는지 수치해석을 통해 확인해 봄으로써 유체영동의 원리를 추가적으로 검증하였다.
이러한 이해를 바탕으로 유체영동을 이용해 실제 생체시료의 크기문제를 해결하는 실험을 수행하였다. 혈액세포의 분리는 면역세포검사, 수혈, 백혈구의 기능연구 등의 다양한 목적을 위해 필요로 되는 기술이다. 혈액세포의 분리에는 세포의 크기 차이를 이용하는데 실제로 적혈구의 지름은 백혈구의 지름과 유사한 6.2~7.3 μm이다. 이 때문에 멤브레인필터를 이용할 경우 혈구의 분리효율이 낮을 수 밖에 없다. 따라서, 유체영동을 이용한 혈액세포의 분리에는 적혈구가 큰 지름과는 달리 1.7~2.6 μm의 얇은 두께를 갖는다는 점과 백혈구보다 변형률이 크다는 점을 이용하였다. 적혈구는 유체영동소자를 구성하고 있는 4 μm 높이의 여과구조물에 평형하게 정렬되고 통과하는 반면 이 보다 큰 크기를 갖는 백혈구의 경우 여과구조물을 통과하지 못하고 적혈구로부터 분리된다. 이러한 여과원리를 이용하여 210배의 높은 농축율을 갖고 백혈구를 분리할 수 있었다. 또한 초당 4000개의 세포를 분리하며 유체영동소자내로 주입된 백혈구 중에 71~85\%를 출구에서 회수하였다. 이렇게 분리된 백혈구는 면역세포검사, 수혈, 백혈구의 기능연구 등에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
세포주기와 관련된 연구도 생물학에 있어서 중요한 크기문제 중에 하나이다. 동물세포의 경우 DNA복제나 세포분열이 세포주기에 의해 엄격하게 조절되고 있다. 이러한 세포조절의 균형이 깨지게 되면 유전적 변형 등이 유발되어 암세포로 발전할 수 있다. 이 때문에 각 세포주기에 관여하는 조절인자의 생리학적 역할 및 발암유전자와의 관계를 밝히는 연구가 중요하다. 또한 이러한 연구를 위해 특정 주기의 세포를 분리하는 기술이 필요한데 이를 세포주기동기화 (cell cycle synchronization) 기술이라 한다. 유체영동을 이용한 세포주기동기화 기술개발에는 M-phase의 세포가 $G_1$-phase의 세포보다 2배 정도 크다는 점을 이용하였다. 실험에는 11~22 μm의 크기를 갖는 U937세포를 이용하였으며 세포의 크기범위를 포함하도록 경사구조물의 높이를 24 μm로 설계하였다. 유체영동소자를 이용해 유체영동에 의해 크기별로 분리된 세포의 분리위치와 세포의 크기 사이에 선형적 상관관계가 있음을 밝혔다. 또한 17 μm보다 작은 세포와 19 μm보다 큰 세포를 분리함으로써 특정주기의 세포를 분리하는 실험을 수행하였다. 분리 후에는 형광염료로 세포핵을 염색한 후 형광세기를 유세포분리기를 이용해 측정하였다. 17 μm보다 작은 세포를 분리한 경우, 대부분의 세포가 $G_1$-phase에 속했으며 분리 후에 $G_1$-phase 세포의 비율이 83.8\%에서 95.5\%로 높아졌다. 19 μm보다 큰 세포를 분리한 경우, 대부분의 세포가 G2/M-phase에 속했으며 분리 후에 $G_2$/M-phase 세포의 비율이 19.7\%에서 85.2\%로 높아졌다. 이를 통해 유체영동기술이 세포주기동기화 실험에 응용될 수 있음을 확인하였다. 이는 앞으로 발암유전자과 세포주기와의 관계, 세포주기와 사멸에 의약품이 미치는 영향 등에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
본 연구를 통해서 마치 엑셀에 숫자를 붙이고 분류 버튼을 누르면 숫자가 정렬되며 분리되는 것처럼 생체시료를 미세채널에 주입하는 것만으로도 쉽고 효과적으로 크기별분리가 가능한 기술인 유체영동을 개발하였다. 앞으로 유체영동 기술이 더 완벽한 분리기술이 되기 위해서 보완해야할 연구과제는 다음과 같다. 우선 유체영동에 의한 크기별 분리범위를 넓히는 연구를 수행해야할 것이다. 현재 유체영동소자의 크기별 분리범위는 경사구조물의 높이와 그 높이의 절반으로 한정된다. 나노미터에서 마이크로미터에 이르는 다양한 입자의 크기별 분리에 유체영동을 이용하기 위해서는 유체영동소자의 분리범위를 넓히는 연구를 수행해야할 것이다. 두번째로 분리량을 들수 있다. 현재 유체영동에 의한 세포 분리량은 최대 초당 수천개로 제한된다. 기존의 유세포분석기가 초당 수만에서 수십만개의 세포를 측정, 분리할 수 있음을 감안할 때, 유체영동의 분리량을 높이는 연구가 수행되어야할 것이다. 마지막으로 단순히 생체입자의 크기별 분리에 그치는 것이 아니라 이를 기반으로 실제 생물학 또는 환경공학에 관련된 문제를 해결하는데 그 노력을 기울어야 할 것이다. 이러한 문제점들을 개선 보완한다면 유체영동이 생체시료의 크기별분리에 있어 최고의 기술이 될 수 있을 것이라고 생각한다.
