Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) is a homo-trimeric DNA-encircling protein that functions as a polymerase processivity factor and also regulator in DNA metabolism. Post translational modification (PTM) on PCNA by Small-ubiquitin-modifier (SUMO) contributes to suppression of hyper-homologous recombination by binding DNA helicase, Srs2. Srs2 is known as DNA helicase that inhibits recombination as it disrupts Rad51 nucleoprotein filaments, functionally cooperates with PCNA and it shows preference for interacting directly with the SUMO-modified form of PCNA. However, the mechanism of interaction between Srs2 and PCNA, and between Srs2 and SUMO remains unclear. Here we show by Nuclear magnetic resonance (NMR) and biophysical analysis that PCNA directly binds with C terminal of Srs2. Our findings suggest a model in which PCNA recruits Srs2 in anti-recombinogetic role of Srs2.
Two-hybrid assay로 Srs2 의 truncated form을 이용해, PCNA와 상호작용하는 지점인 C terminal 137개의 아미노산 부분이 보고되었으나 직접적인 증거는 제시된 바가 없다. 우리는 선행연구에서 137개의 아미노산으로 이루어진 Srs2를 대장균에서 얻어 PCNA와 결합한다는 것을 보일 수 있었고, 더 작은 크기의, 더 안정한, PCNA와의 결합에 반드시 필요한 부분을 찾으려고 노력하던 중, 모델링과 유전적인 근거가 제시된 보고에 근거하여 Srs2 (1115-1174)와 Srs2 (1143-1174)가 후보로 작용할 수 있음을 발견하였다. 역시 PCNA와 결합함을 보여주었던 His-Srs2 (1115-1174)는 발현양이 작았지만 Trx-His tag을 이용하여 더 많은 단백질을 얻을 수 있었고, Trx-His tag을 가진 Srs2 (1143-1174)만으로도 PCNA와 상호작용함을 알 수 있었다. Cross-linking analysis, pull down assay, ITC experiment 과 NMR analysis은 모두 Srs2와 PCNA의 결합을 보여주었으며 특히 high salt조건에서도 동일한 결과를 나타내 PIP-box sequence와 유사한 sequence를 포함하고 있는 Srs2 역시 다른 PIP와 같이 PCNA와 hydrophobic interaction을 하지 않을까 추측할 수 있었다. 또한 ITC로 측정한 dissociation 상수는 수 μM로 SUMOylation되지 않은 PCNA와 Srs2가 약하게 결합함을 보여주는데, 이는 세포 내에 있는 PCNA의 일부만이 SUMOylation되고, 그들만이 modifiy되지 않은 PCNA보다 Srs2와 좀더 강하게 결합한다는 보고와 일치한다. 또한 Srs2의 C-terminal은 구조가 없을 것이라고 예측되는 부분인데 구조가 없던 부분에서 TFE로 α-helix가 유도되는 과정이 CD 스펙트럼으로 관찰되었으며, NMR연구에서는 피크들이 스펙트럼의 중앙에 모여있다가 PCNA와 결합하면서 사라지는 양상을 보여주어 구조적으로 불안정하다가 구조를 형성해가는 것이 아닐까 생각해볼 수 있었다. 이 최소한의 construct는 SUMOylated PCNA와 Srs2의 상호작용에 대한 기초를 제공하고, 더 나아가 상호작용이 Rad51 filament 형성을 저해하는 초기 기작에 대한 분자 생물학적 연구에 도움이 될 수 있겠다.
