Highly sensitive and precisely specify detection technique is one of the most interesting research topics in biotechnology since the essential capabilities it has. Among the various methods to detect the biomolecules effectively, fluorescence-based method is very typical and popular way for detection or identification of biomolecules such as DNAs. Several techniques are developed to enhance the efficiency and capacity of fluorescence detection, and the metal-enhanced fluorescence (MEF) system can be one of the excellent means.
In this thesis, we introduce the large-area novel metal nanopattern as substrates for MEF system which caused by LSPR effect, and it provides the great enhancement of the detection power for very low concentration of fluorophore. Because the target fluorophores are Cy3 and Cy5 in this study, which have the emission wavelength at about 570nm and 670nm, silver and gold are chosen to match the LSPR wavelength with the emission of target fluorophores.
By using CFL process, well-defined metal nanopattern was formed in large-area and the assembly of polyelectrolyte (PET) films provided the proper modified surface for stable immobilization of single strand DNAs.
Fluorescence detection results for various concentrations show that the extremely low concentration of target DNA molecules (~ $10^{-11}$ M) detection is possible from the optimally constructed MEF system. Highly enhanced detection limit of biomolecules will contribute to the precise and effective analyze in the fields of diagnosis or advanced biomolecular engineering.
나노기술분야에서 주요한 목표 중 하나는 정밀하고 정확한 나노구조체를 효율적으로 생산하는 것이다. 나노미터 수준의 패턴을 제작하고 제어하기 위한 다양한 기술이 꾸준히 개발되고 있으며 식각 공정을 통한 리소그래피 방식과 자기조립 방식이 대표적이라고 할 수 있다. 나노패터닝에 있어서 중요한 요소는 해상도와 신뢰도, 공정의 효율성과 재생산성 및 비용 등이 있다. 이러한 요소들을 향상시킨 정확하고 정밀한 패턴을 효율적으로 생산할 수 있다면 이는 나노기술의 실제적 응용과 상용화를 촉진시킬 것이다.
본 연구에서는 소프트 리소그래피 방식의 하나인 캐필러리 리소그래피 (CFL) 방식을 도입하여 수 제곱 mm의 대면적에 균일한 나노패턴을 제작하였다. CFL방식은 100nm 내외의 높은 해상도를 가지고 재생산성이 우수하며 적은 비용으로 대량 생산이 가능하다는 장점이 있다. CFL 방식을 통한 나노패턴은 원형이 되는 마스터 몰드의 형태에 따라 1차적으로 결정되며 공정 과정에서의 조절을 통해 나노구조체의 크기를 제어할 수 있다.
CFL 방식을 통해 금속 나노패턴을 구성하면 표면 플라즈몬 (Surface Plasmon Resonance, SPR)이라는 특수한 광학적 특성을 얻을 수 있다. 표면 플라즈몬은 특정 파장의 광자에 의해 금속 표면의 전자가 공명을 일으키는 현상으로 금속이 나노구조체를 이루고 있을 경우 국한된 표면 플라즈몬 (LSPR) 효과가 발생한다. LSPR의 특성은 나노구조체의 크기와 형태, 금속의 종류 및 주위의 유전체 물질에 따라 결정되며 대면적 패턴을 구성할 경우 그 형태와 크기를 조절함으로써 LSPR의 파장을 제어하고 이용할 수 있다.
나노패턴으로부터 발생하는 LSPR은 주위의 특정파장의 전자기파와 함께 공명을 일으킴으로써 신호를 증폭시키는 효과를 보일 수 있다. 본 연구에서는 대표적 귀금속인 금과 은을 이용하여 대면적 나노패턴을 구성하고 이로부터 발생하는 LSPR 특성을 이용하여 형광신호를 증폭시킬 수 있음을 보였다. 이는 금속에 의해 유도된 형광신호 증폭 효과 (Metal-enhanced Fluorescence, MEF)를 증명하는 것으로 생명공학에서 대표적으로 사용되는 형광물질인 Cy5와 Cy3가 라벨링 된 DNA를 사용하여 확인하였다. Cy5는 670nm의 방출파장을 가지며 640nm 정도의 LSPR 파장을 갖는 금 나노패턴 기판을 구성함으로써 형광신호가 향상됨을 관찰할 수 있었다. 또한 Cy3는 570nm의 방출파장을 갖는 형광물질로 비슷한 파장대에서 LSPR효과를 보이는 은을 이용하여 나노패턴을 제작함으로써 증폭효과를 확인하였다. Cy5와 Cy3의 형광신호는 적절하게 구성된 금속 나노패턴 위에 위치할 경우 $10^{-11} M$ 농도에서도 신호 검출이 가능함을 확인하였으며 $10^{-7}$ ~ $10^{-6} M$ 이상의 농도에서 검출이 가능한 일반적인 경우와 비교할 때, 검출한계가 크게 향상되었음을 알 수 있다.
이와 같이 증폭효과를 보고자 하는 형광물질의 방출파장과 LSPR파장이 중첩되도록 금속 나노패턴을 구성할 경우 형광물질 방출파장의 세기가 증가하는 것을 관찰할 수 있다. 이는 금속 나노구조체에서 발생하는 LSPR효과가 형광물질에서 방출되는 광자의 에너지를 증가시키고 여기 상태에 있는 전자의 효율을 향상시키기 때문이다.
본 연구에서는 CFL방식을 이용하여 금속 나노패턴을 구성함으로써 금속의 종류와 나노구조체의 크기를 자유롭게 조절함으로써 LSPR 특성을 유연하게 조절할 수 있음을 보였다. 또한 이러한 금속 나노패턴으로부터 발생하는 LSPR특성을 통해 형광물질이 라벨링 된 DNA로부터 발생하는 형광신호를 증폭시킴으로써 검출한계를 크게 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 정밀한 진단 등 생명공학에서 바이오 물질 검출의 성능을 크게 향상시킬 수 있는 가능성을 내포하며 대면적 패턴을 통해 실용화가 용이한 시스템을 구성할 수 있다.
