Circadian rhythms of various physiological events are driven by endogenous molecular clocks. Two transcriptional feedback loops maintain molecular clock system in Drosophila melanogaster. dCLOCK (dCLK) and CYCLE (CYC) form a heterodimer, and activates period (per) and timeless (tim) transcription via binding to specific enhancer element (E box). The PER and TIM proteins accumulate and translocate to nucleus, and repress the transcriptional activity of dCLK/CYC. VRILLE (VRI) and PAR DOMAIN PROTEIN 1ε (PDP1ε) which are induced by dCLK/CYC feedback to regulate clk expression as a transcriptional repressor and activator, respectively.
Reversible phosphorylation of clock proteins has essential parts of circadian time keeping. Phosphorylation of proteins in circadian system is key steps that regulate the activity, stability and subcellular localization.
In this study, we showed that PDP1ε is phosphorylated protein in vivo and in a cultured cell system. DBT kinase phosphorylates PDP1ε in S2 cells and in vitro. In addition, PDP1ε is dephosphorylated by silencing endogenous DBT activity. We also found DBT interacts with PDP1ε. DBT activity of PDP1ε phosphorylation promotes its degradation by ubiquitin-proteasome pathway. PDP1ε is a exclusive nuclear protein. However, PDP1ε nuclear localization was disrupted in absence of DBT activity. These results demonstrate that DBT regulates phosphorylation, stability and localization of PDP1ε, and has multiple targets in circadian timekeeping system.
To study the role of Pdp1ε in adult circadian clock, Pdp1-GAL4 and UAS-pdp1 RNAi were generated to inhibit Pdp1ε expression in Pdp1ε expressing neurons. Pdp1 RNAi driven by Pdp1-GAL4 or tim-GAL4 disrupts PDP1ε expression in pacemaker neuron, LNs. Surprisingly, dCLK expression in circadian pacemaker cell of Pdp1ε mutant flies is similar to that in control flies. The core circadian oscillator was not disrupted in Pdp1ε mutants. Other factors may be involved in rgulating dClk mRNA cycling. However, behavior rhythmicity is lost even if circadian clock functions normally. Dorsal projections from mutants have extensive branches or abortive shapes. These results suggest that PDP1ε is necessary for normal neuronal projection or mediates rhythmic transcriptional activation of output genes.
생체 내에서 일어나는 수많은 생리 작용들의 일주기성 주기는 내재 되어 있는 분자 시계에 의해 생성된다. 초파리의 분자 생체 시계는 두 개의 전사 피드백 고리로 형성된다. 생체 시계 단백질의 가역 인산화 반응은 생체 주기를 조절하는데 중요한 역할을 담당하고 있다. 이들 단백질은 인산화는 활성, 안정도, 생체 내 위치 등을 조절하는데 중요한 역할을 한다.
본 연구에서 PDP1ε 단백질은 생체 내와 세포배양 환경에서 인산화된 단백질이라는 것이 밝혀졌다. DBT는 PDP1ε 단백질의 인산화를 담당하는 효소였으며, 배양된 세포와 in vitro에서 PDP1ε를 인산화하였다. 또한 배양된 세포의 DBT를 억제하면 PDP1ε의 인산화가 감소되었다. DBT와 PDP1ε는 서로 결합하고 있으며, DBT에 의한 PDP1ε의 인산화는 유비퀴틴 프로테아좀 경로를 통해 분해를 유도하였다. PDP1ε 단백질은 핵내에 존재하는데 DBT의 활성을 억제하면 핵내 위치한 PDP1ε 단백질의 양이 감소하였다. 이를 통해 DBT가 PDP1ε의 인산화와 안정도, 세포내 위치를 조절하는 것을 밝혔다. 성체 초파리의 생체 시계에서 PDP1ε의 역할을 알아보기 위해 Pdp1ε RNAi를 통해 PDP1ε의 발현을 억제시켰을 때, PDP1ε에 의해 활성화된다고 알려진 dClk의 발현량이 변화하지 않는 것을 발견하였다. 또한 생체 주기 조절 세포에서 생체 시계가 정상적으로 작동하였다. 이는 PDP1ε 말고 다른 유전자가 dClk의 전사활성을 조절한다는 것을 의미한다. 하지만 이들 PDP1ε 돌연변이 파리들은 비정상적인 생체 활동 주기를 보여주었고 뇌내의 신경 돌기들이 비정상적으로 뻗어져 있거나 단절되어 있었다. 이는 PDP1ε이 두뇌의 생체 주기 관련 신경 돌기 형성에 중요하거나 생체 시계과 활동 주기를 연결하는 역할을 담당하고 있음을 의미한다.
