We developed an innovative genetic immobilization method by expressing recombinant proteins on the surface of bacterial spore. An outer spore surface protein of Bacillus cereus group, exosporium, was used as fusion partner to display recombinant proteins. The stability of the exosporiumanchored proteins on extreme conditions, heat, solvent and etc, was investigated, very high because of resistance of spore matrix. Thus, the efficient surface expression on exosporium surrounds Bacillus spores as vehicle for efficient heterologous protein presentation, together with the high stability, makes the spore-presented proteins to powerful in vivo immobilized biomolecules. Flow cytometry, fluorescence assay and confocal laser scanning microscopy were used to monitor surface expression of recombinant proteins on purified spores. The surface-display systems of DNA, peptide/protein and antigen/antibody to the exosporium were studied for biotechnological applications, such as DNA hybridization assay, peptide/protein and antigen/antibody interaction assay. As in this reason, it has many potential capacities to biotechnological applications. And also, this exosporium protein could be used anchoring motif for cell surface display in Escherichia coli. Enhanced green fluorescent protein and streptavidin were successfully displayed by exosporium protein in E. coli.
현재까지 알려진 표면발현 기술(cell surface display technology)은 모두 표면단백질중의 하나 또는 몇 개를 활용한 형태로 목적단백질이 표면발현되어 세포 또는 포자(spore)의 표면구조가 변형될 수 있다. 하지만, 본 연구에서는 유전자담체를 포자의 최외곽에 외막단백질(exosporium)과 목적단백질을 융합 (fusion)하여 숙주세포 내부 또는 외부로 발현하면 자연스럽게 유전자담체에 에워싸진 형태로 표면발현할 수 있는 새로운 표면발현방법을 개발하였다.
유전자담체중 세포가 Bacillus thuringiensis, B. anthracis, B. cereus를 포함한 B. cereus 군과 및 B. subtilis 등을 포함하는 Bacillus 속 미생물에서 발현될 수 있으며, 대장균(Escherichia coli)에서도 표면발현모체(surface display motif)로 이용되어 질 수 있다. 특히, 대장균에서는 특히 B. anthracis의 포자외막단백질인 BclA를 표면발현모체로 이용하였으며, N-말단, N-, C-말단, 그리고 전체를 모두 표면발현모체로 이용할 수 있었다.
포자표면발현된 단백질은 포자의 고유한 특성 때문에 여러 가지 악조건에서도 안정하게 이용될 수 있으며 특히, 분자 진화(directed evolution), 전세포생촉매(whole cell biocatalysis), 흡착제(adsorbent), 및 바이오칩(cell chip), 패턴(cell patterning) 등 다양한 생물공학적 접근방법에 이용될 수 있다.
포자외막단백질을 이용한 spore display system은 단백질 운반체, DNA 운반체, 항원(antigen) 및 항체(antibody) 운반체로 이용할 수 있는데 이를 이용한 생물공학적 잠재력이 높다고 할 수 있다. 단백질 운반체로서는 CMCase, $\beta$-galactosidase를 발현하여 생촉매로서 이용될 수 있었으며, 녹색형광단백질(EGFP)을 이용한 live cell patterning, 간염 바이러스(hepatitis B virus)에 대한 항체(single-chain antibody) 및 severe acute respiratory syndrome coronavirus(SARS-CoV)에 대한 항원을 이용한 biochip, 그리고 streptavidin-biotin interaction을 이용한 병원균 검출법(pathogen detection) 및 single nucleotide polymorphisms (SNPs genotyping) 등이 구현되었다.
