In this research, we have been proposed and demonstrated a label-free field-effect sensing array integrated with CMOS readout circuitry to detect the surface potential determined by the negative charge in deoxyribonucleic acid (DNA) molecules for real-time detection and quantification of the products generated by polymerase chain reaction (PCR) process. Moreover, we have explored a non-surface binding detection technique which is the measurements of DNA molecules without immobilizing them on the sensing surface for the real-time sequential monitoring of their concentrations because DNA detection method using immobilization and hybridization is not suitable for real-time measurement.
For implementing field-effect sensing array with CMOS readout circuitry, we have proposed a BioFET with the top-layer metal (90×90 $\mu m^2$ native $Al_2O_3$/Al) electrode which is connected to the floating gate of the sensing transistor. This allows the device to be fully compatible with standard CMOS process. The sensing electrodes are easily formed by sharing the same passivation layer opening mask with the bonding pads pattern, so that no additional processes are required to fabricate the sensing devices.
For direct measurement of the surface potential change due to DNA molecules, we have proposed an operational amplifier circuit scheme by replacing proposed BioFET in one of the input transistors in a differential input stage. The field-effect transistor connected to the sensing electrode is integrated into the differential input stage of the folded-cascode amplifier to configure a voltage follower. From this circuit configuration, we can acquire the output voltage equal to the surface potential of the sensing electrode. Furthermore, the proposed sensor includes an on-chip noise reduction circuitry for suppressing offset fixed pattern noise and 1/f noise of the devices.
A prototype sensor has been fabricated using 1-㎛ double-poly double-metal standard CMOS process. In this prototype, the three pixel arrays are incorporated in their respective sample flow chambers defined by silicone rubber, so that three different bio-samples can be loaded and monitored simultaneously. One pixel array is exposed to a calibrated buffer solution in a reference chamber in order to compensate any background noise or signal drift in the electrolyte and electrode interface. Each pixel array has total 16 sensing elements for collecting statistically-sufficient data and minimizing random noise in the sample by averaging the measured signals. The variable gain amplifier integrated on-chip with the sensor performs the subtraction of signals (between the sample and the reference signal) and amplifies the difference.
We have detected and quantified DNA molecules in a buffer solution by measuring the change in the surface potential of the BioFET array. To increase a detectable range, a phosphate buffer (PB) solution with very low concentration (0.01 mM) has been used. 19-bp oligonucleotides with various concentrations have been successfully measured by the direct detection of DNA negative charges without any immobilization process on the sensing electrodes. The surface of the sensing electrodes can be easily regenerated by rinsing with a buffer solution followed by DNA injections, allowing the continuous monitoring of DNA samples. Furthermore, we have investigated the sensitivity and the dynamic range enhancement in different buffer conditions and theoretically analyzed the effect. As a result, proposed sensor shows better performance in pH 7 buffer solution than in pH 6. The limit of detection is 1.1 ng/μl and the dynamic range is 40 dB from 1.1 ng/μl to 110 ng/μl. The measured offset noise of demonstration chip is 400 μV which is smaller by a factor of twelve than that measured without noise reduction scheme. Low offset noise makes the minimum detectable signal decreased.
Total power consumption is 40mW at 5V supply voltage. Due to the mechanical constraint in the special jig design which provides an electrical connection between the sensor signal pads and the test board and fluidics components such as micro-chamber and tubing system, the chip size becomes relatively large, 16.5mm × 16.5mm. We expect the size can be significantly reduced by using a custom package in the future work and this sensor can be easily integrated to a micro PCR chip for real-time monitoring of PCR process.
폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 원하는 DNA를 증폭하고 검출하는 기술은 많은 응용분야에서 사용할 수 있어 각광받고 있다. 특히 최근 들어 PCR 반응을 하나의 작은 칩에서 수행함으로써 전력 및 시료를 효율적으로 사용하고 처리 속도를 빠르게 하려는 연구가 진행되고 있다. 이를 micro PCR chip이라 하는데 이에 발맞추어 증폭된 DNA의 양을 정량화하기 위해 현재까지 널리 쓰이고 있는 형광식 검출 방법이 아닌 전자식 검출 방법이 많은 관심을 받고 있다. 그 이유는 형광식 검출 방법은 많은 주변 기기들을 필요로 하기 때문에 micro PCR chip과 집적하여 하나의 칩으로 구현하는 것이 힘들고 실시간 검출이 불가능하지만 전자식 방법은 그것이 가능하기 때문이다.
전자식 검출 방법은 DNA 분자 자체가 가진 전기 특성들을 전자 소자들로 감지하는 것으로 여러 가지 방법들이 소개되고 있다. 이중에서 DNA 분자가 가지고 있는 음전하를 ISFET으로 검출하는 방법은 DNA 분자에 label 처리를 할 필요가 없고 CMOS 공정을 사용하여 제작할 수 있어 전하를 감지하거나 신호 대 잡음비를 늘려주기 위한 검출 회로와 쉽게 집적이 가능하다는 장점을 가지고 있기 때문에 micro PCR chip으로의 응용 분야에 적용될 가능성이 매우 높다. 따라서, 본 논문에서는 이러한 micro PCR chip에 집적할 수 있도록 ISFET 소자를 이용한 DNA 정량화 센서를 제안하고 실시간으로 DNA를 정량화할 수 있는 방법을 제안하였다. 또한 제안된 방법 및 측정 결과를 분석하여 센서의 성능을 높이기 위한 방법을 제시하였다.
먼저 제안된 센서는 CMOS 공정을 이용한 새로운 구조의 감지 소자를 가지며 저주파 잡음을 제거하기 위한 회로와 집적되어 있다. CMOS 공정을 이용하여 ISFET을 제작하기 위해서는 기존의 공정에 추가로 공정이 더 필요하게 되고 이는 비용의 증가 및 소자 간 특성 차이를 심화시킨다. 따라서 추가적인 공정이 필요 없도록 최상위 금속 배선 층을 감지 전극으로 사용하고 이 전극을 감지 트랜지스터의 gate와 연결하는 구조를 제안하였다. 감지 전극은 알루미늄으로 공기 중에서 산화되어 산화 알루미늄 층이 생기고 이 층이 용액 내에 있는 DNA 분자의 음전하에 반응하여 감지 전극의 전압을 바꾸게 된다. 감지 전극의 전압을 검출하기 위해 기존에는 drain 전류를 측정하여 간접적으로 전압의 변화를 계산하였으나 이 방법은 소자 간 특성 차이에 따라 많은 영향을 받게 되고 이를 보정하기 힘든 단점이 있다. 또한, 센서의 신뢰도를 높이기 위해 소자를 어레이(array) 형태로 배치할 경우 누설 전류나 기생 캐패시터에 영향을 무시할 수 없게 된다. 이러한 문제를 해결하기 위해 각 감지 화소 내부에 버퍼로 증폭기를 두었으며 전극의 전압을 직접 감지하기 위해 source follower로 구성하였다. 또한, 이를 작은 면적에 구현하고 각 화소 별 이득률의 편차를 줄이기 위해 전극이 연결된 트랜지스터는 source follower의 입력단이 되고 나머지 입력단 및 출력단은 모든 화소가 공유하는 구조를 제안하였다. 더불어, 각 감지 트랜지스터로 인하여 발생하는 오프셋의 편차 및 증폭기의 저주파 잡음을 줄여주는 상관 이중 샘플링 (correlated double sampling, CDS) 회로를 집적하여 센서의 감지도를 높일 수 있도록 설계하였다.
다음으로 DNA의 양을 실시간으로 검출하기 위하여 새로운 검출 방법으로 DNA 분자를 전극 위에 고정화하지 않는 non-surface binding 방법을 제안하였다. 기존에는 ISFET 센서로 DNA를 검출하기 위해서 고정화 및 혼성화 방법을 사용하였으나 이 방법은 시간이 오래 걸리고 전극을 다시 사용하기 힘든 단점이 있어 실시간 검출에는 적합하지 않았다. 이론적으로 감지 전극으로부터 일정 거리 이하 내에 존재하는 전하들이 전극의 전압에 영향을 줄 수 있기 때문에 고정화를 하지 않고 DNA의 양을 검출할 수 있을 것으로 생각하여 고정화 없이 직접 측정하였다. 이 방법은 반응 속도가 매우 빠르고 버퍼 용액을 주입함으로써 쉽게 전극의 초기화가 가능하므로 DNA 용액과 버퍼 용액의 순차적인 주입을 통해 여러 가지 농도의 DNA를 연속적으로 측정이 가능하다.
제안된 센서는 1-㎛ CMOS 공정으로 제작되었으며 하나의 센서에 4개의 챔버를 두어 동시에 4가지 용액을 측정할 수 있다. 이 중 한 챔버는 기준 용액만을 주입하고 다른 챔버의 결과와 빼줌으로써 용액 내부 및 용액과 전극 사이에서 발생할 수 있는 공통 잡음을 줄일 수 있다. 또한 각 챔버는 16개의 감지 화소를 포함하여 동시에 통계적으로 의미 있는 자료를 얻을 수 있으며 이를 평균하여 임의 잡음을 줄일 수 있다. 제작된 센서로 고정화 없이 여러 가지 농도의 DNA를 측정한 결과 농도에 따라 감지 전극의 전압 변화가 다르게 나타남을 확인하였으며 버퍼 용액으로 씻어냄으로써 쉽게 전극의 초기화가 가능함을 알 수 있었다. 센서의 감지도를 높이기 위하여 매우 낮은 농도인 0.01 mM phosphate buffer (PB)를 사용하였고 실험 결과의 분석을 통해 버퍼 용액의 pH가 7일 때 감지도가 향상되는 것을 관찰하였다. 측정 결과 최소 감지 농도는 1.1 ng/μl, 최대는 110 ng/μl 이었고 이는 현재 사용되고 있는 PCR 결과물의 농도 범위와 일치한다. 센서의 저주파 잡음은 CDS를 사용하였을 경우 0.41 mV로 사용하지 않았을 경우에 비하여 12배 향상되었고 최소 농도일 때 최소 전압 변화는 2.8 mV로 잡음을 최소 신호에 비해 훨씬 낮출 수 있었다.
이상에서 기술한 바와 같이 본 논문에서 구현한 CMOS DNA 센서는 실시간으로 DNA 분자의 농도를 측정하는 응용에 충분한 감지도를 보였다. 따라서 제안된 센서는 micro PCR chip과 집적하여 실시간 DNA 증폭 및 결과 분석을 할 수 있는 Lab-on-a-Chip 개발에 응용될 수 있을 것이라 할 수 있다.
