Polydiacetylenes (PDAs) have been tested as signal transducers for biosensors due to their unique color-changing properties in response to environmental changes such as pH, temperature and molecular binding, As most of the PDA-based sensors reported to date were tested for detecting purified samples, however, their specificity has been rarely evaluated. The molecular mechanism corresponding to the color change is believed to be an irreversible structural transition undergone by the conjugated backbone of the polymer. Such a transition is most likely associated with perturbations to the pendant side chains of the PDA following molecular processes affecting the PDA interface.
In this study, novel PDAs that were fabricated on PVDF strips by photoreaction of composite diacetylene self-assemblies were tested for biosensors with minimal nonspecific binding to unwanted-biomolecules. The PDA surface of biotin and ethanolamide bound more specifically to streptavidin than that of biotin only. The optimized PDA biosensor showed more sensitive signal by about 2,850-fold to streptavidin than to bovine serum albumin, a control protein.
To apply the point-of-care testing using PDA-based strip, we investigated a novel strip technology utilizing PDA-conjugate antibody. We conjugated a Microalbuminuria antibody to PDA liposome containing mixed monomer with 60% PCDA and 40% TCDA-OH to reduce the nonspecific binding. The prepared PDA-conjugate antibody was immobilized on the lateral flow strip with nitrocellulose membrane. A blue zone of immobilized PDA-conjugate antibody was changed into red color through antibody-antigen interaction. The PDA-based POCT was available to detect the signal transition without metal-conjugate detector antibody. To enhance our system, furthermore, we also combined with metal-conjugate method for simultaneously optical and fluorescence detection. This investigation would be potentially useful for point-of-care testing and diagnosis with or without metal conjugation of detector biomolecules.
We herein investigated polydiacetylene liposomes for minimized nonspecific binding with biomolecules in the aqueous solution. The PDA liposomes were prepared with mixed monomers using 10,12-pentacosadiynoic acid (PCDA) and derivative of 10,12-tricosadiynoic acid (TCDA-OH) having ethylene oxide linker and hydroxyl end group. The resulting PDA solutions showed a thick blue color for a short-time (≥10 sec) exposure under 254 nm. Upon the addition of bovine serum albumin (BSA) before and after polymerization, the prepared PDA liposomes appeared a color change from blue to purple above 1hr followed by their aggregation and precipitation in the various solutions. However the PDA liposome containing 40% TCDA-OH monomer was lower color transition than others liposome solutions and no aggregation. Consequently, this composition for biosensor would be attractive for specific binding in aqueous solution.
Utilizing the fluorescence property of single polydiacetylene (PDA) liposome, we here in describe a nanoscale detection strategy for biotin-streptavidin binding by employing a near-field scanning optical microscopy (NSOM). The amine-terminated PCDA $(PCDA-NH_2)$ liposome was immobilized on an aldehyde glass surface followed by photopolymerization using 254 nm UV excitation source of light. For the biotin-streptavidin binding, we conjugated photoactivatable biotin (photobiotin) with the immobilized $(PCDA-NH_2)$ liposomes by exposing it to a UV radiation wavelength of 365 nm, and then interacted it with streptavidin. We analyzed the transformed fluorescence emitted by the immobilized liposomes by using a microarray scanner, and detected single nanosized liposomes which had reacted by using a near-field scanning optical microscope (NSOM). The average height and NSOM signal of a single liposome after binding took place between biotin-streptavidin was approx. 31.3 ~ 8.5 ± 0.5 nm and 0.37 ~ 0.16 ± 0.6 kHz. This work would greatly benefit single molecule detection technology in the nanoscale without using any fluorescent label.
To the best of our knowledge, this is the first strip-type biosensor fabricated with PDAs and the first endeavor to overcome the non-specificity problem in PDA-based biosensing. The findings here suggest that mixed self-assembly of PDAs can be applied for the development of practical strip biosensors with high sensitivity and specificity for the target detection.
센서란 측정 대상물을 감지하거나 그로부터 정보를 측정하여 유용한 신호로 변화하는 물질 및 장치이다. 특히, 화학 및 생체관련 물질을 이용하여 선택성과 감도를 향상시킨 바이오센서는 진단과 치료를 목적으로 고안되었다. 그러나 생물학적인 요소들의 대상물질을 검출함에 있어서 감도 및 선택성의 보강이 필요하며, 안정성에도 문제가 없는 센서의 개발이 필요하다. 이런 문제점의 보완과 새로운 방식의 센서 개발을 위해 비표지 방식이면서 화학·생물학적 요소등 다양한 분야와 접합이 용이하며, 기존 센서시스템의 기본 구성요소인 감지물질과 신호변환기 성질을 가지는 공액고분자(conjugated polymer) 폴리디아세틸렌(polydiacetylene)을 이용한 센서의 개발이 활발히 진행되고 있다. 폴리디아세틸렌은 환경의 변화에 따라 전도성(conductivity), 산화-환원 전위차(redox potential), 흡수(absorption) 또는 방출(emission) 스펙트럼의 변화를 가지는 공액고분자중의 하나이다. 그러나 다른 공액고분자와는 달리 폴리디아세틸렌은 양친성 단량체들의 중합형태로서, 단량체인 디아세틸렌은 수용액상에서 3차원적인 구조로 쉽게 자기조립이 이루어지는 장점을 가지고 있다. 이렇게 형성된 3차원 구조는 254 nm에서 근접하고 있는 단량체와 삼중결합 사이에 중합이 이루어지면서 무색이었던 수용액이 650 nm 부분에서 최대 흡수 파장이 있는 파란색의 수용액으로 바뀌게 된다.
파란색의 폴리디아세틸렌은 외부의 환경 요인에 따라 색이 변화하는 특징을 가지고 있다. 예를 들어, 온도, pH, 화학물질 또는 생체물질(항체, 단백질, 펩타이드, DNA) 등의 접근이나 결합이 이루어지면 붉은색(550 nm) 쪽으로 색전이가 이루어지게 된다. 이런 외부요인(Stress)의 정도에 따라 색전이가 다르게 나타나며, 파란색에서는 나타나지 않던 형광특성이 색전이가 많이 생길수록 630 nm 부분에서 최대 방출(emission) 에너지가 강하게 나타나는 특성이 있다. 유색적인 변화와 더불어서 형광특성까지 가지고 있는 폴리디아세틸렌 구조체의 색전이 현상에 대한 정확한 메커니즘은 규명되지 않았지만 중합된 폴리디아세틸렌 구조가 다양한 요인에 의해 변형이 이루어짐으로써 색전이가 나타난다고 보고 있다. 한편으로는, 다양한 외부요인에 의한 색이 쉽게 변화는 장점이 오히려 단점으로 작용할 수 있다. 생물학적인 요인들의 검출에 사용하고 있는 바아오센서는 특이적인 반응에 대한 신호만 요구되기 때문에 비특이적인 반응에 매우 민감하다.
본 연구에서는 비특이적인 반응을 최소화하면서 특이적이고 민감한 반응을 할 수 있는 폴리디아세틸렌 기반 센서의 개발 및 응용에 있다. 먼저 폴리디아세틸렌 단량체는 두가지를 준비하였다. 일반적으로 폴리에틸렌 옥사이드(PEG)나 수산기(OH)는 비특이적인 반응을 최소화한다는 기존 연구에 근거하여 폴리디아세틸렌에 에틸렌 옥사이와 수산기를 갖도록 유도체(TCDA-OH)를 합성하였다. 또한 streptavidin과 특이적인 반응이 되도록 바이오틴(biotin)이 결합된 또 하나의 폴리디아세틸렌 유도체를 합성하였다. 기존의 연구에 있어서는 폴리디아세틸렌을 이용한 센서는 대부분 리포좀이나 유리기판 위에 필름을 형성하여 사용하였다. 그러나 본 연구에서는 구조체를 형성하기 전 용매(Chloroform)에 용해된 폴리디아세틸렌 단량체들(TCDA-OH와 PCDA-biotin)을 PVDF membrane에 직접 자기조립 시킴으로써 간단한 센서의 제작과 함께 특이적인 반응을 볼 수 있었다. 기존의 방법과는 달리 수용액상에서 구조체를 형성하지 않고도 지지체에 직접 자기조립시켜서 센서에 적용할 수 있었으며, BSA와 같은 단백질에 대한 비특이적인 반응을 최소화 할 수 있었으며, BSA에 비해 약 3000배 정도의 특이성을 갖는 센서를 개발하였다.
폴리디아세틸렌 기반 센서를 산업적으로 사용하기 위해 POCT (Point-of-care testing) 스트립 센서의 개발도 수행하였다. 가장 안정했던 60% TCDA-OH와 40%PCDA조성으로 리포좀을 형성한 후, 신장병 질환에 있어서 많이 분비되는 Microalbuminuria을 검출하고자 하였다. 먼저 준비된 리포좀에 EDC/NHS반응을 이용하여 PCDA의 카르복실기를 공유결합으로 Microalbuminuria 항체와 쉽게 결합이 가능하였다. PDA 리포좀에 항체가 결합된 용액을 Dispenser를 이용하여 nitrocellulose membrane 스트립에 고정화를 시켰다. 스트립에는 항원과 결합이 가능한 또 다른 항체를 고정화하는conjugation pad, 항원을 주입하는sample pad, 주입된 용액을 흡수하는 absorption pad로 이루어져 있으며, membrane위에서는 샌드위치 방식으로 고정화된 항체에 결합하게 된다. 결합된 항원-항체는 폴리디아세틸렌의 색을 전이시키면서 형광이 나타나도록 하였다. 따라서 기존의 금속 나노입자의 표지로 검출했던 방법과는 달리 육안뿐만 아니라 형광으로도 검출이 가능한 스트립 센서를 개발하였다.
비특이적인 반응을 최소화할 수 있는 단량체 TCDA-OH를 포함한 바이오센서를 위해 수용액상에서 구조체 형성이 가능한 폴리디아세틸렌 조성 및 BSA의 존재하에 최소화된 비특이적인 반응과 안정한 구조체의 형성을 확인하였다. TCDA-OH의 비율이 많아지면 친수성의 증가로 리포좀과 같은 구조의 형성이 어려워 침전이 이루어지는 반면에 80% 미만의 조성에 있어서는 PCDA와 혼합하였을 때 구조체를 형성할 수 있었다. 특히 40% TCDA-OH와 60% PCDA 조성에서는 BSA의 첨가에도 오랜 시간 동안 (21시간) 색이 변화하지 않고 구조체의 변화에도 영향이 미치지 않는 가장 적절한 조성을 확인하였다.
폴리디아세틸렌 하나의 리포좀에서 이루어지는 단백질의 반응을 검출하기 위해 고정화된 리포좀에 바이오틴 관능기를 부여하고 streptavidin을 결합시켰다. 특이적인 반응이 이루어진 리포좀에서는 색 전이가 이루어지고, 없던 형광이 나타나게 되며, NSOM을 이용하면 단일 리포좀에서 발산하는 형광을 감지할 수 있었다. 비록 생물학적인 반응의 모델을 적용하였지만 본 결과로 다양한 단백질- 단백질 반응이나 다른 생물학적 요인들의 반응에 있어서 낮은 농도 또는 적은 양으로도 NSOM을 이용하면 Nanoscale에서 이루어지는 반응에 대한 연구에 중요한 역할을 할 것으로 본다.
본 연구에서는 폴리디아세틸렌 구조를 센서에 적용함에 있어서 비특이적인 반응을 최소화 할 수 있는 유도체를 혼합하여 사용함으로써 보다 특이적이면서 민감한 스트립 센서나 POCT용 센서를 개발하였다. 또한 최소화된 비특이적인 반응의 최적 조건을 다양한 분야에 응용이 가능하였다.
