L-fucose for mammalian glycosylation contains an anomeric carbon atom generating α and β-L-fucoses. Based on sequence comparison of mouse and human homologs with the procaryotic fucose mutarotases (FucU) characterized, we investigated their function in mammalian cell culture system as well as in the mouse model system for FucU deficiency.
By NMR measurement with saturation difference analysis, the purified mammalian mutarotases were demonstrated to be involved in an interconversion between the two anomeric forms with comparable efficiency as that of the E. coli FucU. The mouse gene was widely expressed in various tissues and cell lines, including kidney, liver, and pancreas, although expression was marginal in testis. By generating stably expressed cell lines for mutarotase genes in HepG2, it was shown that fucose incorporations into cellular proteins were increased as demonstrated by an incorporation of radiolabeled fucose into the cells. Furthermore, intracellular levels of GDP-L-fucose, measured with HPLC, were enhanced by an overproduction of cellular mutarotase, which was reversed by gene silencing of mutarotase based on RNA interference. In addition, we observed intracellular accumulation of lipid due to over-fucosylated lipases as well as a change in cell morphology. The results suggest that the mammalian mutarotase is functional in facilitated incorporation of fucose through the salvage pathway.
We observed a change in sexual behavior in the mutant mouse, in which the gene for fucose mutarotase (FucU) was homozygously knocked out. The mutant female mouse was characterized to be defeminized by avoiding the sexual mounting by male mouse and greatly lowering the lordosis behavior, an indicator of sexual receptivity in female. Rare intromission occurs through forced approach by male without involving lordosis. The mutant female even exhibited a masculine behavior such as mounting female partner. This abnormality in recognizing sexual partner is likely to be due to a change in olfactory circuit, since the mutant female exhibited strong preference to female urine. The masculinization phenotype is corroborated with an observation that sensing female urine elicits neuronal activation of the pheromone-specific olfactory bulb as well as an expression of c-Fos in the posterior bed nucleus of the stria terminalis (BNST) and the medial preoptic area (MPOA). We investigated proteomic changes of developing mouse embryos from normal and mutant FucU mice by analyzing two-dimensional SDS-PAGE and noticed a pronounced difference in fucosylated serum alpha-fetoprotein that has been implicated in female sexual receptivity. It was demonstrated that the decrease in secretion of alpha-fetoprotein into blood due to repressed fucosylation reduced its binding to estradiol, thereby inhibiting development towards female brain in the mutant mouse. The FucU knock out mouse may provide a neuron-developmental model for behavioral change in sexual preference.
포유류 당화과정에 필수적인 푸코오스 (L-fucose)는 α-와 β-구조를 형성할 수 있는 아노머 탄소 원자를 가지고 있다. 기능이 규명되어있는 원핵 생물의 푸코오스 변성광 효소 유전자 (fucose mutarotase, FucU)와 생쥐 및 사람 유사체들 사이의 서열비교를 토대로 하여, 포유류 FucU의 기능을 세포 배양과 더불어 FucU 결핍 생쥐 모델 시스템에서 조사하였다. 정제된 포유류 변성광 효소가 두 아노머 형태의 당 구조 상호변환에 관여하며 대장균 FucU와 비슷한 효율을 가짐을 핵자기 공명을 이용해 증명하였다. 생쥐의 유전자는 고환에서의 발현은 적었으나 신장, 간, 췌장을 포함하는 다양한 조직들과 세포주에서 발현되었다. FucU 과발현 HepG2 세포주를 만들었고, 방사성 표지 푸코오스를 이용해 세포주내 단백질에 당 축적이 증가하였음을 관찰하였다. 게다가, 구아노신 2인산 푸코오스 (GDP-fucose) 합성 수준이 FucU 과발현 세포주에서 향상되었음을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 통해 확인하였고, 이러한 현상은 RNA간섭에 의해 반전됨을 알 수 있었다. 또한 이들 세포주에서는 당 대사 과정 변화뿐만 아니라 세포의 형태 및 지방 축적 변화가 관찰되었는데, 이것은 리파아제 (lipase)의 당화 이상에 의한 것이었다.
푸코오스 변성광 효소의 개체 수준에서의 기능을 규명하기 위해 유전자 결손 생쥐를 제작하였고, 성행동 이상을 관찰하였다. FucU 유전자 결손 암컷 생쥐는 순응성 척도로 간주되는 척추전만 현상 (lordosis)이 현저히 감소된 탈여성화 (defeminization) 표현형을 보였다. 뿐만 아니라, 이 돌연변이 암컷은 다른 암컷에게 올라타기를 시도하는 웅성화 (masculinization) 행동을 보이기까지 했다. 이런 성행동 이상 증상은 후각 회로의 이상에 의한 것임을 요 선호도 테스트를 통해 확인했으며, 뇌의 후각 신경 관련 부분인 BNST와 MPOA에서 c-Fos의 활성 변화가 신경학적으로 성행동 이상 현상을 뒷받침 한다. 유전자 결손에 의한 성행동 이상을 단백체학 분석을 이용해 분자적 수준에서 추적해 본 결과, 생쥐 태아의 혈청내 alpha-fetoprotein (AFP)의 당 수식 이상을 발견하였다. 당 수식 이상이 생긴 AFP는 태아의 뇌 발생 과정에서 estradiol의 차단에 관여하지 못 하고, 이는 유전자 결손 생쥐의 성행동 이상으로 진행된다. 본 연구에서 사용된 푸코오스 변성광 효소 결손 생쥐는 성행동 변화의 신경 발생학 모델로 적합함을 알 수 있다.