Over the past decades, Chinese hamster ovary (CHO) cells became the most widely used mammalian cells for high-level expression of foreign therapeutic proteins ranging from antibodies to growth factors in industry. It is well-established that, when the most nutrients are deprived during batch culture, cells lose their viability and eventually die through the complex mechanisms of programmed cell death (PCD). Especially, apoptosis and autophagy were investigated. In this study, we have used two different antibody producing CHO cell lines, Ab1 and Ab2. Two cell lines were cultivated in different media containing high (25.0 mM glucose and 4.0 mM glutamine) or low (5.6 mM glucose and 2.0 mM glutamine) nutrient. Thus, they showed different growth profiles and antibody production profiles. However, both cell lines stopped proliferating and producing antibodies when the nutrient was deprived. We have shown that CHO cells were undergoing apoptotic and autophagic cell death towards the end of batch culture. Apoptotic cell death was demonstrated by chromosomal DNA fragmentation in addition to the cleavage of PARP protein, and autophagy was evidenced by the accumulation of 16 kDa form of LC3-II (an autophagosomal protein that is processed from 18 kDa to 16 kDa upon autophagy induction) and autophagic vacuoles.
Since it is well known that anti-apoptotic CHO cell engineering is important for achieving a high-level protein production in large-scale culture, one of the major survival proteins, Akt (a serine/threonine kinase) was overexpressed in Ab1 and Ab2 cell lines. Akt is known to be activated by growth factors or cellular stresses and was found to function upstream of a major regulator of autophagy, mammalian target of rapamycin. Several studies showed that Akt activation inhibited cell death caused by apoptotic signal (Kauffmann-Zeh et al. 1997; Kennedy et al. 1997; Kulik et al. 1997). The constitutively active Akt (CA-Akt) was generated by Kohn et al., (Kohn et al. 1996) by deleting 4129 amino acids and adding 14 amino acid src myristoylation signal. Pleckstrin homology (PH) domain at the NH2 terminal of Akt is found to be unnecessary for its activation by insulin or growth factor in CHO cells (Franke et al. 1995) and the attachment of src myristoylation signal to target Akt to the membrane increased its basal activity by phosphorylation (Cross et al. 1984).
Stable wild type Akt (WT-Akt) or CA-Akt overexpressing cell was obtained after transfecting the expression plasmid, which has EGFP in order to show transfection efficiency. Individual clones were isolated and the correlation between EGFP and Akt was confirmed by Western blot analysis. In order to avoid clonal variations, mixed pool was used in this study. After generating stable WT-Akt, CA-Akt and the control cells, all pools were adapted to serum-free suspension culture. Batch culture was performed in the presence/absence of serum. CA-Akt overexpressing Ab2 cells showed longer culture period and higher viability only in the absence of serum and in the presence of high glucose in the media by delaying apoptosis and autophagy. Extended culture longevity could result in longer antibody production period.
In addition to nutrient deprivation during batch culture, mild stress such as hyperosmotic stress or sodium butyrate (NaBu) used to enhance protein productivity often cause cell death. It has been reported that hyperosmolality by adding sodium chloride (NaCl) or NaBu induces growth inhibition and cause apoptotic cell death with a relatively high concentration. The concentration of NaCl or NaBu was optimized; up to 100 mM NaCl or 3 mM NaBu, cells were able to grow and the antibody productivity was enhanced. After confirming that the cells were undergoing mild stress conditions by adding 100 mM NaCl or 3 mM NaBu, the growth of WT-Akt and CA-Akt overexpressing cells as well as the control was compared in serum-free suspension culture. CA-Akt cells showed less apoptotic death caused by mild stress as indicated by the cleavage of caspases and PARP and chromosomal DNA laddering. Therefore, CA-Akt overexpressing cells showed higher viability at the end of batch culture and extended growth.
In this study, we have shown that CA-Akt could delay apoptosis and autophagy induced by nutrient deprivation during batch cultures of antibody-producing CHO cells. Also, under mild stress conditions such as hyperosmolality or NaBu addition, CA-Akt overexpressing cells exhibited longer culture period as well as higher viability. By showing that CA-Akt has a protective role in cell growth; it is suggested to engineer apoptotic genes as well as autophagic genes at the same time. Simple autophagy-related gene engineering might not provide the cell survival. In order to enhance overall protein productivity, it is needed to engineer not only genes related to autophagy but also the key mediators of metabolism in addition to the regulators of apoptosis, since autophagy is not a sole cause of PCD during batch culture. Both PCDs should be considered when engineering CHO cells to achieve longer culture period and higher antibody production.
Chinese hamster ovary (CHO) 세포는 지난 수년간 항체로부터 성장 인자에 이르는 의료용 외래 단백질의 고농도 생산을 위한 포유 세포로서 산업적으로 가장 많이 이용되고 있다. 회분 배양 (batch culture) 기간 동안 대부분의 영양분이 고갈될 때, CHO 세포는 생존율이 저하되고 복잡한 세포 예정사의 과정을 거쳐 결국 죽는다는 것은 이미 많이 연구가 되어있다. 특히, apoptosis와 autophagy의 두 종류의 세포 예정사에 대해 연구하였다.
본 연구에서는 두 가지 다른 항체를 생산하는 Ab1 과 Ab2의 CHO 세포주를 이용 하였 다. 두 세포주는 각각 다른 농도의 글루코스와 글루타민이 함유된 배지에서 배양되었다. 따라서 그 두 세포주는 성장 특징이나 항체 생산 형태가 다른게 나타났다. 그렇지만 두 세포주 모두 양분이 고갈됨에 따라 생장과 항체 생산을 멈추었다. CHO 세포주가 회분 배양후반부로 갈수록 apoptosis와 autophagy 두 형태의 세포사멸을 하였다는 충분한 증거를 보여주었다. Apoptosis로의 세포 사멸은 PARP 단백질의 분열 뿐 아니라 염색체 DNA의 절단을 통해 알 수 있었고, autophagy는 16 kDa형태의 LC3-II (autophagy의 유도로부터 18 kDa에서 16 kDa로 잘라지는 autophagosomal 단백질)과 autophagic 액포 (vacuole)의 축적으로 알 수 있었다.
세포 사멸을 억제하는 CHO 세포 공학은 대량으로 고농도 단백질 생산을 하는데 매우 중요하기 때문에, 주요한 생존 단백질 중의 하나인 serine/threonine의 인산화 효소 Akt 를 Ab1과 Ab2 세포주에서 과발현하였다. Akt는 성장인자 혹은 세포의 스트레스에 의해 활성화 된다고 알려져 있으며, autophagy의 주요한 조절 요인인 포유류 세포에서의 라파마이신 표적 (mammalian target of rapamycin)의 상위 조절에 작용한다고 밝혀졌다. 수많은 연구를 통해 Akt의 활성화는 apoptosis 신호로부터의 세포 사멸을 억제한다고 알려져 있다 (Kauffmann-Zeh et al. 1997; Kennedy et al. 1997; Kulik et al. 1997). 항상 활성화 된 Akt (constitutively active Akt, CA-Akt) 는 4에서 129번까지의 아미노산을 제거하고 14개의 아미노산 src 미리스틸화 (myristoylation) 신호를 첨가함으로써 Kohn 등에 의해 제작되었다 (Kohn et al. 1996). Akt의 아미노 말기 플렉스트린 상동 영역 (pleckstrin homology domain) 은 CHO 세포에서 인슐린이나 성장 인자로 인한 Akt의 활성화에 필 수적이지 않고 (Franke et al. 1995), src 미리스틸화 (myristoylation) 신호를 통한 Akt의 세포막으로의 이동은 인산화를 통한 기본적인 활성도를 증가 시킨다 (Cross et al. 1984).
트랜스펙션 (transfection) 효율을 보여주기 위한 EGFP를 함께 가지고 있는 발현 유 전자를 도입함으로써, 안정적인 야생형 Akt (wild type Akt) 혹은 CA-Akt의 과발현 세포주가 만들어졌다. 각각의 클론이 분리되었으며, 면역 블롯 (Western blot) 분석을 통해 EGFP와 Akt의 발현량의 상관관계가 확인되었다. 클론별 차이를 극복하기 위하여 혼합 된 세포를 사용하였다. 안정적인 WT-Akt, CA-Akt, 그리고 대조군 세포주를 만든 다음, 모든 혼합세포군은 무혈청 부유 배양에 적응되었다. 혈청이 존재하거나 존재하지 않는 회기 배양을 실시하였다. CA-Akt를 과발현하는 Ab2 세포주가 apoptosis와 autophagy를 지연시킴으로써 혈청이 없고 배지내 포도당이 높은 환경에서 배양 기간이 길어짐을 알 수 있었다. 확장된 배양 기간은 항체 생산 기간을 증대시켰다.
회분 배양 기간 동안의 양분 고갈 이외에도, 생산성을 증대시키기 위해 사용되는 고 삼투 환경이나 뷰티르산 염 (sodium butyrate)의 첨가 등의 경미한 스트레스 환경에서도 종종 세포 사멸이 유도된다. 상대적으로 높은 농도의 염 (NaCl) 혹은 뷰티르산 염 (sodium butyrate)으로 인해 세포의 성장이 저해되고 apoptosis로 인해 세포의 사멸이 유발되는 것 이 많이 보고 되어 있다. 염과 뷰티르산 염의 농도를 최적화하였다; 100 mM까지의 염 혹은 3 mM의 뷰티르산 염까지 세포는 성장이 가능했으며, 항체 생산성이 증가하였다. 100 mM 의 염, 또는 3 mM의 뷰티르산염의 첨가에 의해 세포는 경미한 스트레스 환경에 처해졌으며, 무혈청 부유 배양에서 WT-Akt, CA-Akt 과발현 세포주와 대조군 세포주의 성장을 비교하였다. CA-Akt 과발현 세포주가 caspase와 PARP 분열과 염색체 DNA의 절단을 통해 apoptosis로 인한 사멸 정도가 적었음을 알게 되었다. 따라서, CA-Akt과발현 세포주는 배양 후반부에 높은 생존율과 확장된 생장을 나타냈다.
본 연구에서, CA-Akt가 항체를 생산하는 CHO 세포의 회분 배양에서 양분 고갈로 인해 유도되는 apoptosis와 autophagy를 억제하는 결과를 보였다. 또한, 고삼투압이나 뷰티르산 염의 첨가와 같은 경미한 스트레스 환경에서, CA-Akt의 과발현 세포는 높은 생존률과 배양 기간 증대의 효과를 나타냈다. CA-Akt 과발현 세포가 세포를 사멸로부터 보호하는 결과를 보임으로써, apoptosis에 관련된 유전자뿐 아니라 autophagy에 관련된 유전자를 동시에 연구하는 것이 제시되었다. 단순한 autophagy 관련 유전자 공학은 세포의 생장을 유도할 수 없을지도 모른다. 최종 단백질 생산성을 높이기 위해, apoptosis 관련 조절자 외에도 autophagy관련 유전자뿐 아니라 대사에서 중요한 중개자들을 연구하는 것이 필요하다. 배양 기간의 확장과 항체 생산 증대를 위한 CHO 세포 공학을 할 때, 두 가지 종류의 세포예정사 모두가 고려되어야 한다.
