To achieve enhanced cell growth and increased product concentration in serum free media, three non-animal derived hydrolysates were used as additive to serum-free basal medium (SF-A, SF-B) previously developed in our laboratory. Following the statistical design, Simplex Lattice, 10 kinds of serum free media supplemented with various proportions of yeastolate, soy hydrolysate, and wheat gluten hydrolysate (total 5g/L) were prepared. Each of the ten media was used in batch cultures of three rCHO cell lines, producing ABC antibody (C11-08), anti-4-1bb antibody (H-1-5), and human TPO (R-2-3-2), respectively. For the C11-08 and H-1-5 cell lines, the maximum viable cell concentration was decreased or increased by about 0.7- 1.6 fold compared to the control medium, which had no supplementation of hydrolysate. The Maximum product concentration was increased by over 2-fold in all media except for the medium supplemented with only wheat gluten. For the R-2-3-2 cells, yeastolate was the most suitable additive unaccompanied by other hydrolysates. The effect of each medium was analyzed by the statistical program, $Design-Expert^\textregistered$, to reconstitute the mixture ratios of the three hydrolystes for high growth and high production. The resulting mixture for high growth, gave a maximum viable cell concentration increased by about 1.3 - 1.6 fold compared to the control medium and in the mixture for high production gave a maximum product concentration increased by about 2 - 7 fold. Effects of the hydrolysate mixtures for high growth and high production were maintained during serum free adaptation for 6 passages and remained after serum free adaptation in C11-08 cell lines.
To investigate clonal variation of recombinant Chinese hamster ovary (rCHO) clones in response to culture pH and temperature, serum-free suspension cultures of two antibody producing CHO clones (clone A and B), which were isolated from the same parental clone by the limiting dilution method, were performed in a bioreactor at pH values in the range of 6.8 - 7.6 and two different temperatures, 33℃ and 37℃. In regard to cell growth, clone A and clone B displayed similar responses to temperature, though their degree of response differed. In contrast, clone A and B displayed different responses to temperature in regard to antibody production. In the case of clone A, no significant increase in maximum antibody concentration was achieved by lowering culture temperature. The maximum antibody concentration obtained at 33℃ (pH 7.4) and 37℃ (pH 7.0) were $82.0\pm2.6$ and $73.2\pm4.1 ㎍/mL$, respectively. On the other hand, in the case of clone B, an approximately 2.5-fold increase in maximum antibody concentration was achieved by lowering culture temperature. The enhanced maximum antibody concentration of clone B at 33℃ $(132.6\pm14.9 ㎍/mL at pH 7.2)$ was due to not only enhanced specific antibody productivity but also to prolonged culture longevity. At 33℃, culture longevity of clone A also improved, but not as much as that of clone B. Taken together, CHO clones derived from the same parental clone displayed quite different responses to culture temperature and pH regarding antibody production, suggesting that environmental parameters such as temperature and pH should be optimized for each CHO clone.
To increase a foreign protein production in recombinant CHO cell lines, effects of culture environmental factors (pH and temperature) and limited nutrient (glucose, glutamine, amino acid, and vitamins) feeding on cell growth and foreign protein production were investigated. When culture pH conditions changed from pH 7.6 to 7.0, the production of Fc-fusion protein was increased significantly. The maximum titer, about 250 ㎍/mL, was obtained at pH 7.0 and pH 7.2. Finally, pH 7.2 condition was selected as an optimal pH condition for further study after considering both cell growth and Fc-fusion protein production. As culture temperature conditions changed from 37℃ to 33℃, the maximum titer was significantly increased from 250 ㎍/mL to 527 ㎍/mL with the enhanced specific production rate. By feeding of additional glutamine at exponential growth phase, cell density was increased from $1.47 x 10^6cells/ml$ to $2.98 x 10^6cells/ml$. Feeding of glucose with vitamins and amino acids at stationary phase significantly increased maximum product titer up to 870 ㎍/mL. However, as the cell growth was enhanced, specific productivity was decreased reciprocally, which resulted in no further increased in production by a combined effects of glutamine and glucose feeding.
Lactate, one of the major waste products in mammalian cell culture, can inhibit cell growth and affect cellular metabolism at high concentrations. To reduce lactate formation, lactate dehydrogenase-A (LDH-A), an enzyme catalyzing the conversion of glucose-derived pyruvate to lactate, was down-regulated by an expression vector of small interfering RNAs (siRNA) in recombinant Chinese hamster ovary (rCHO) cells producing human thrombopoietin (hTPO). Three clones expressing low levels of LDH-A, determined by RT-PCR and an enzyme activity test, were established in addition to a negative control cell line. LDH-A activities in the three clones were decreased by 75-89%, compared with that of the control CHO cell line, demonstrating that the effect of siRNA is more significant than that of other traditional methods such as homologous recombination (30%) and antisense mRNA (29%). The specific glucose consumption rates of the three clones were reduced to 54-87% when compared to the control cell line. Similarly, the specific lactate production rates were reduced to 45-79% of the control cell line level. In addition, reduction of LDH-A did not impair either cell proliferation or hTPO productivity. Taken together, these results show that the lactate formation rate in rCHO cell culture can be efficiently reduced through the down-regulation of LDH via siRNA.
To investigate the effect of human pyruvate carboxylase (hoctate formation in Chinese hamster ovary (CHO) cell lines, FLAG-tagged hPC was introduced into dihydrofolate-deficient CHO cell line (DG44). Three clones expressing high levels of hPC, determined by Western-blotting using an anti-FLAG monoclonal antibody, as well as a control cell line were established. Immunocytochemistry revealed that a substantial amount of expressed hPC protein was localized in the mitochondria of the cells. hPC expression did not impair cell proliferation. Rather, it improved cell viability at the end of adherent batch cultures with serum-containing medium probably due to reduced lactate formation. Compared with control cells, specific lactate production rate of the three clones was decreased by 21%-39%, which was due to a decreased specific glucose uptake rate and yield of lactate from glucose. Reduced lactate formation by hPC expression was also observed in suspension fed-batch cultures using serum-free medium. Taken together, these results demonstrate that through the expression of hPC enzyme, lactate formation in CHO cell culture can be efficiently reduced.
재조합 CHO 세포주를 이용한 치료용 단백질의 생산에 있어 고효율의 무혈청 배지를 개발하는 것은 세포주 개발 이후에 생산공정에 가장 큰 영향을 주는 요건 중의 하나이다. 실험실에서 개발된 무혈청 기본배지에 비동물성 유래 가수분해산물 (hydrolysate)을 첨가함으로써 약 4주 정도의 빠른 시간안에 각각의 세포주에 적합한 무혈청 배지를 개발하는 방법을 연구하였다. 세 가지의 가수 분해산물인 Yeastolate, soy hydrolysate, wheat gluten hydrolysate를 통계적인 디자인을 통해 10가지의 혼합비율로 섞어 기본배지에 첨가한 후 인간화 항체를 생산하는 세포주 (C11-08, H-1-5)와 혈소판 증식인자를 생산하는 세포주(R-2-3-2)의 무혈청 부유배양을 통해 세포의 성장과 치료용 단백질의 생산에 미치는 영향을 관찰한 후 통계 분석 프로그램(Design-Expert)을 이용하여 그 결과를 분석하였다. 각각의 세포주에 따라 세포의 성장과 생산에 가장 적합한 가수분해산물들의 혼합비율은 다르게 나타났고, 최적의 혼합비율로 혼합물을 재구성한 후 세포배양을 통해 그 효과를 확인 하였다. 그 결과 최고 세포 농도는 기본배지와 비교하여 30-60%의 향상을 보였고, 최고 단백질 농도는 200% - 700%의 향상을 나타냈다. 이러한 효과는 6회의 개대 배양동안의 무혈청 적응기간과 그 이후에도 지속됨이 관찰되었다.
세포주 개발과 무혈청 배지개발 이후 생산량을 더욱 증가시키기 위해서는 배양 온도 및 pH와 같은 환경인자의 최적화가 필요하다. 인간화 항체를 생산하는 같은 모세포로부터 유래한 2가지의 clone 세포주 (clone A and B)를 동물세포배양기를 통해 각각 pH 6.8 - 7.6의 조건과 37℃, 33℃에서 배양하여 그 결과를 관찰하였다. A, B 두 세포주 모두 pH의 변화에 낮은 온도의 배양에서는 다른 결과를 보였다. 두 세포주 모두 저온배양에서 세포 성장이 저해되는 경향을 보였으나, A 세포주는 낮은 온도에서 최대 항체 농도가 거의 증가되지 않은 반면 B 세포주의 경우에는 저온배양에서 (33℃, pH 7.2) 최대 항체 농도가 250% 정도 증가되었다. 이러한 생산량의 증가는 단위세포당 생산량의 증가와 더불어 저온배양을 통한 배양기간의 연장에 기인한 것이었다. 같은 모세포로부터 유래한 비슷한 세포주들의 경우에도 환경인자에 따른 세포의 성장과 항체생산량의 변화에는 큰 차이가 있고 이러한 결과로부터 각각의 생산세포주에 대한 환경인자의 최적화는 필수적이라는 결론을 내릴 수 있었다.
더욱 높은 수준의 생산량에 도달하기 위해서는 환경인자의 최적화와 함께 세포 배양 중에 부족하게 되는 영양성분들을 추가적으로 공급해 주어야 한다. Fc-fusion 단백질을 생산하는 세포주의 경우 배양 pH의 조절을 통해 조절이 되지 않는 조건에서의 120mg/L 수준의 생산량에서 250mg/L까지 향상되었고, 이 후 33℃ 저온 배양을 통해 약 530mg/L 수준까지 생산량이 증가되었다. 이렇게 최적화된 조건에서 배양 초기에 추가적으로 glutamine을 공급함으로써 최대 세포 농도는 기존의 1.47 x 106cells/mL에서 $2.98 x 10^6cells/mL$까지 향상 되었다. 또한 배양 중반 이후 추가적인 glucose, vitamin, amino acids등의 공급을 통하여 870mg/L 까지 생산량이 증가하였다. 하지만 세포의 성장이 향상됨에 따라 단위세포당 생산량이 감소하는 현상이 나타나 더 이상의 추가적인 생산량의 향상은 없었다.
동물세포배양에서는 세포의 성장과 생산성, 그리고 단백질의 품질의 저하를 일으키는 부산물이 생산되며 유가식 배양 같은 고농도의 세포배양에서 심각한 문제가 될 수 있다. Lactate는 이러한 부산물 중 주요물질로서 그 농도가 높아지면 세포의 성장 및 다른 대사 과정에도 영향을 끼치는 것으로 알려져 있다. 혈소판 증식인자를 생산하는 세포주에서 이러한 lactate의 생산을 감소시키기 위해 glucose로부터 유래된 pyruvate를 lactate로 전환시키는 효소인 LDH-A (lactate dehydrogenase-A)를 siRNA 기술을 이용하여 down-regulation하여 그 효과를 관찰하였다. 가장 낮은 LDH-A 효소 활성을 나타내는 세 개의 clone 세포주는 기존의 세포주와 비교하여 11% - 25% 수준의 활성을 나타냈다. 이들 세포주의 세포 배양 중 단위 세포당 lactate의 생산량은 기존의 값의 45 - 79% 수준 이었다. Glucose의 단위 세포당 소비량은 54 - 87%로 감소하였다. 이렇게 낮은 LDH-A 효소 활성과 lactate생산량을 보이는 세포주들은 세포성장과 혈소판 증식인자의 생산량에 있어 저하되는 경향을 보이지 않았다. Lactate의 생산량을 감소시킬 수 있는 또 다른 방법으로써 glucose로부터 유래된 pyruvate를 TCA cycle에서 ATP를 생산하는데 사용될 수 있도록 전환시키는 PC (pyruvate carboxylase) 효소를 과발현 시킨 후 결과를 관찰하였다. Immunocytochemistry를 통해 발현된 PC 효소 중 상당량이 세포 내 mitochondria에 위치함을 알 수 있었다. PC 효소를 과발현하는 세포주들은 혈청배지와 무혈청 배지를 이용한 배양에서 배양 후반부에 향상된 생존율을 나타냈으며, 단위 세포당 lactate 생산량은 61-79%수준으로 낮아졌다. 이는 단위 세포당 glucose의 소비량이 감소되고 glucose로부터 lactate로 전환되는 비율이 낮아졌기 때문인 것으로 나타났다. 이러한 효과는 무혈청 배지를 이용한 유가식 부유배양에서도 지속적으로 관찰되었다.
