Cultivation-based techniques have traditionally been the primary tools utilized for studying the microbiology of food environments. Recently, nucleic acid-based methods have been employed to further characterize the microbial diversity in food. In Jeotgal sampes, both in fish and shrimp, pH was low 5.5-7.5, so more than 70% microbial population belongs to the Firmicutes bacteria and they might have major role in lactic acid production. By using both cultivation-dependent and -independent methods, it was proved that both methods are working together and to understand the true picture of microbial diversity in food, we have to improve the culture method so that with less labour and time consuming, it might be able to grow more and more bacteria. Culture method supported the fast growing bacteria but by changing the traditional method and with the combination of molecular methods, this can be a good technique to understand the microbial ecology of any environment. Random cloning helped to see not only uncultured bacteria but many new groups in prokaryotes and eukaryotes which could not be cultivated in cultivation method, so this method showed superiority to culture method. Although T-RFLP has shown the clear peak difference among the samples, but there is still extensive need to improve the method of DNA extraction especially in food, which has lot of inhibitors for PCR reaction. During the DNA extraction, a lot of DNA is lost; it should be saved by improvement. During the analysis of bacterial diversity, a lot of cultureable group appeared in both cultivation-dependent and -independent methods, e.g. Bacillus, Staphylococcus, Tetragenococcus, Atopostipes, Haloanaerobium, Carnobacterium and some other group which are not studied at all or very little in other foods and there is no describable reference for them. Some of them can be grown on the wide range of temperature, NaCl, and pH, like Bacillus and Staphylococcus. They can be tried as a starter and then by lowring the NaCl concentration and increasing the temperature, duration of fermentation can be reduced.
Usually in Jeotgal, NaCl is used 15-20% and at very low temperature 10-15°C, it takes about 6-12 months to complete the start to ripening process. These both problems can be solved by changing the fermentation system. Shrimp-Jeotgal has high pH than fish-Jeotgal and this is more vulnerable to contamination with human pathgens like E. coli, Staphylococcus aureus, and Salmonella typhimurium or some toxic yeast group. This food is also a source of lot of known and unknown yeast community and they might have minor or major role in the Jeotgal fermentation. It is also great need to cultivate them, do proper characterization and apply them according to their possible role in fermentation. Inspite of major groups which are halophilic or halotolerant or low pH tolerant, there are also some minor groups, like Methylobacterium jeotgali, which cannot tolerate low pH and high salt and are non-spore forming and can utilize ethyl alcohol etc. There is also great need to check the proper role of minor groups, whether involved in fermentation or in protecting the food from pathogens. In this food, there was not a single strain of human pathogens like E. coli, Staphylococcus aureus, and Salmonella typhimurium, recoved by both, cultivation-dependent and -independent methods. The possible reason is high salt content (more than 10%), low pH (5.5 in fish-Jeotgal and 7.5 in shrimp-Jeotgal) and also presence of some probiotic bacteria and yeast (Chapter 1). The bacterial community can vary from time to time and place to place, and food to food form, so there is great need to check bacterial diversity with the passage of time with both cultivation-dependent and cultivation-independent methods.
Consequently, a more comprehensive assessment of microbial diversity in Jeotgal, traditional Korean fermented seafood, can be obtained by using a combination of cultivation- and molecular-based techniques than by using either method alone.
미생물을 평판배지에 배양하는 배양의존적 방법은 식품미생물학을 연구하는데 전통적으로 가장 많이 이용되어져 있다. 최근에는, 핵산 염기서열을 근간으로 하는 배양비의존 방법이 도입되어 식품에서의 미생물 다양성의 연구가 점진적으로 깊이있게 진행되고 있다. 본 연구는 한국 사람들의 식탁에 흔히 올라오는 해산물 자원의 발효숙성 공정을 이용한 생선젖갈과 새우젖갈의 미생물 다양성을 고전적인 배양의존 방법과 핵산 염기서열을 이용한 배양비의존 방법을 이용하여 고찰하고자 하였다. 보통 젓갈은 6개월에서 12달까지의 발효숙성 과정을 거쳐 최종적으로 출하게 된다. 샘플링한 두 샘플의 pH는 5.5-7.5 정도였으며 염농도는 10-20%였고 저장온도는 10-15℃에 유통되고 있었다. 발효숙성과정을 거친 젓갈은 그 저장기간이 길어지는데 거기에 관여하는 미생물이 실제로 어떤 종류의 미생물인지를 바로 배양의존 및 배양 비의존 방법 (클론 라이브러리 및 T-RFLP)으로 관찰하였다. 그 결과 70% 이상의 미생물 군집이 Firmicutes 문속에 속했으며 이들은 상당부분 젖산을 생성할 수 있는 미생물들이었다. 특히나 배양 비의존 방법은 기존의 한천배지에서 자랄 수 없는 미생물을 직접적으로 고찰할 수 있기에 식품에 존재하는 미생물의 성상을 더욱 더 사실적으로 관찰할 수 있게 해 주었다. 배양 비의존 방법은 속도와 경제적인 면에서도 배양의존방법보다 우수하나 실질적인 미생물 균주를 확보할 수 없다는 치명적인 단점이 있기 때문에 응용이 가능한 성장이 빠른 미생물의 확보를 위해서라도 배양방법을 더욱 개량하지 않으면 안 되었다. 배양의존 방법과 배양비의존 방법을 적절히 사용하면 어떤 환경에서라도 미생물 생태를 이해하는데 아주 좋은 기술이 된다. 클론라이브러리 기술은 원핵미생물과 진핵미생물들의 배양되지 않은 미생물들을 관찰하는데 도움이 되었다. T-RFLP 기술은 생선젓갈과 새우젓갈 각 샘플간의 차이를 보여주는 패턴을 확실히 보여주었다. 배양의존 방법과 배양비의존 방법으로 박테리아의 다양성을 관찰한 결과 배양가능했던 그룹인 예를 들어 Bacillus, Staphylococcus, Tetragenococcus, Atopostipes, Haloanaerobium, Carnobacterium 그룹들과 식품에서는 잘 알려지지 않았던가 전혀 알려지지 않았던 그룹들이 많이 발견되었다. 이들 중 Bacillus 나 Staphylococcus 같은 균주들의 일부는 넓은 영역의 온도와 염분, pH에서 자랄 수 있었다.
새우젓갈은 생선젓갈보다 높은 pH를 가지고 있으며 인간의 병원균인 E. coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium 또는 일종의 효모그룹의 오염에도 취약하다. 이 젓갈식품은 전에 다소 알려지거나 알려지지 않은 효모그룹의 원천 소스로서 발효작용에도 많은 기여를 하는 것으로 밝혀졌다. 이들을 배양하여 정확한 특성을 파악하고 더 나아가 발효공학에 응용하는 게 필요하다. 젓갈샘플에서 우점종을 차지하고 있는 호염성 내지 내염성 및 내산성 균주들의 등살을 제치고 내산성 및 내염성이 없고 포자형성도 하지 않는 지극히 평범한 Methylobacterium jeotgali 같은 균주가 소량으로 공생하고 있었다. 이것은 자연의 들어나지 않은 오묘한 이치가 숨겨져 있는 것이었다. 이 젓갈 식품에는 배양의존 및 배양 비의존 두 방법에서 모두 E. coli, Staphylococcus aureu 나 Salmonella typhimurium 같은 인간병원균이 단 한 사례도 발견되지 않았다. 이것은 젓갈의 10% 이상이 되는 높은 염도와 생선젓갈 같은 경우 5.5라는 다소 낮은 pH, 그리고 유산균과 효모균으로 대표될 수 있는 프로바이오틱의 존재일 것으로 사려되었다. 박테리아의 군집은 시간대별로, 식품별로, 장소별로 다양할 수밖에 없기 때문에 시간과 장소에 따른 박테리아의 수많은 다양성을 바로 배양 의존 및 배양 비의존 방법에 의하여 지속적으로 연구해볼 필요가 있는 것을 남겨둔다. 마지막으로, 이 연구결과를 바탕으로 한국의 전통적인 해산물 발효식품인 젓갈에서의 미생물 다양성의 이해가 증진되었다.
